查看更多>>摘要:[目的]花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)严重威胁花鲈养殖业安全,无特效防控药物,早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用.建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法,可为LMIV的基层诊断提供技术支撑.[方法]利用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA),针对LMIV ATPase基因高保守区设计 1 套单交叉引物.以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板,对反应体系中的引物浓度比,Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO4、dNTP浓度,以及反应温度和反应时间进行优化;结合一次性核酸试纸条,建立可视化检测LMIV-CPA的方法.[结果]最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0 µmol/L,引物F3 和B3 均为 0.4 μmol/L,探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为 0.8 μmol/L;MgSO4 浓度为 6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为 0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为 0.256 U/µL;最佳反应温度为 62℃,最佳反应时间为45 min.扩增产物经凝胶电泳检测呈梯形条带,带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测,在3~5 min内即可通过是否出现特征性条带而使反应结果可视化.该方法可特异性地检测出LMIV,不与其他水生常见病毒和常见细菌发生交叉反应.使用LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测 156 份临床样品,LMIV-CPA的阳性检出率为 93.30%,常规PCR方法的阳性检出率为 85.83%;在比较二者的灵敏度差异时,LMIV-CPA的检测限为 102 copies/µL,灵敏度为常规PCR的 10 倍,综合结果显示LMIV-CPA优于PCR.[结论]LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于LMIV的现场快速检测,为花鲈LMIV的准确快速诊断和有效防控提供技术支撑.