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期刊信息/Journal information
南方农业学报
广西壮族自治区农业科学院
南方农业学报

广西壮族自治区农业科学院

李杨瑞

月刊

2095-1191

nfnyxb@163.com

0771-3243905、3244920

530007

广西南宁市大学东路174号

南方农业学报/Journal Journal of Southern AgricultureCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊是由广西农业科学院主办的综合性农业科技期刊，主要报道农业科研新成果、新技术、新方法，农业生产新经验、新产业等。
正式出版
收录年代

    猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

    刘思雨何颖卢冰霞赵武...
    1238-1248页
    查看更多>>摘要：[目的]进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达，制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体，并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)，为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。[方法]以PDCoV 1468B毒株为模板，构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14，经双酶切和测序鉴定后，通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白，将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体，进行Western blotting验证，并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板，采用方阵滴定法优化一系列反应条件，构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。[结果]在构建的pET32a-NSP14重组质粒中，NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达，其大小约40。2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上，经Western blotting验证，能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选，确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4。0 μg/mL，包被条件为37℃、2。0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1。0 h;待检血清按1∶400稀释，孵育2。0 h;酶标二抗1∶2500稀释，孵育60。0 min;TMB底物显色时间为30。0 min。特异性试验结果表明，猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0。235，说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应，特异性良好。重复性试验结果表明，优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10。000%，说明优化的ELISA具有较好的重复性。[结论]成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体，并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA，可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

    猪丁型冠状病毒NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

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