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合成生物学
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合成生物学/Journal Synthetic Biology JournalCSCDCSTPCD北大核心
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    蓝细菌CRISPRa系统的开发及其代谢工程应用

    王甜甜朱虹杨琛
    824-839页
    查看更多>>摘要：蓝细菌是光合作用研究的模式生物之一,也是构建光能自养细胞工厂的良好底盘.然而目前蓝细菌的遗传操作工具仍然较为缺乏且效率较低,开发高效的蓝细菌基因调控工具对于蓝细菌系统与合成生物学研究具有重要意义.本研究在模式蓝细菌聚球藻PCC 7942中开发了CRISPR激活系统,测试了多个转录激活因子,将内源的RNA聚合酶ω-亚基RpoZ与无DNA切割活性的dCas9融合表达,利用高强度启动子表达向导RNA,进而敲除内源rpoZ基因并优化了dCas9-RpoZ的表达及靶向位点.利用建立的CRISPRa系统对重要生物燃料——异戊烯醇的生物合成途径进行了工程改造,该系统不仅能够实现单基因或多基因的高表达,还可以同时对不同基因进行转录激活和抑制,将蓝细菌中异戊烯醇的产量提高了17倍,展示了该系统有望成为构建光能自养细胞工厂的有力工具.

    蓝细菌CRISPRa异戊烯醇

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    限制性内切酶的无细胞快速制备研究

    刘晚秋季向阳许慧玲卢屹聪...
    840-851页
    查看更多>>摘要：限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性.而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备.本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达.经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(Eco RⅠ 3.7×105～3.7×106 U/mg,Bam HⅠ8.3×102～4.1×103 U/mg,BsaⅠ 4.4×105～4.4×106 U/mg)的目标蛋白.同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究.本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1～2 d)、蛋白产量高(32.5～130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×105～5.7×108 U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路.

    限制性内切酶无细胞蛋白合成酶蛋白制备酶活检测合成生物学

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    征稿简则

    封3页
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