查看更多>>摘要:目的 探讨雷帕霉素(RAPA)-深共晶溶剂(DES)滴眼液对小鼠同种异体角膜移植免疫排斥反应的抑制作用及其机制.方法 采用CCK-8实验检测10种DES对人角膜上皮细胞系(HCECs)细胞活性的影响,选择细胞活性显著高于对照组的DES检测其表征,筛选最适宜DES,并通过BALB/c小鼠和新西兰大白兔对最适宜DES进行生物相容性评价.将小鼠随机分为正常组、磷酸盐溶液(PBS)组、DES组和RAPA-DES组.正常组正常饲养小鼠,PBS组、DES组和RAPA-DES组小鼠右眼行角膜移植术,术后小鼠右眼分别滴加PBS、DES和RAPA-DES溶液,隔天通过裂隙灯观察角膜移植物的存活状况,评估角膜移植物的生存百分比并绘制角膜移植物生存曲线.于移植术后第7、16天,取小鼠眼球,苏木素-伊红(HE)染色,于显微镜下观察角膜水肿和炎症浸润情况.于移植术后第16天,经实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组小鼠角膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA的表达水平.并通过蛋白质免疫印迹试验(WB)检测各组小鼠角膜组织中IL-6和IL-17α蛋白表达水平.结果 CCK-8实验显示,与对照组比较,DES-1和DES-2组细胞的细胞活性显著升高(P<0.05),DES-1组细胞的细胞活性较DES-2组高(P<0.05),且DES-1的黏度低于DES-2,pH值更接近于7.4,因此DES-1为最适宜DES,应用于后续实验.生物相容性评价结果显示,DES-1对小鼠和新西兰大白兔眼球和角膜均无任何刺激.相比PBS组,RAPA-DES组的角膜植片在术后第7、16天更透明,无明显水肿和新生血管现象.RAPA-DES组与PBS组、RAPA-DES组与DES组相比,角膜移植物的生存百分比显著升高(P<0.05).PBS组、DES组和RAPA-DES组小鼠角膜移植物的中位生存时间分别为16、16和22 d.HE染色结果显示,PBS组和DES组小鼠角膜移植物明显水肿,有大量炎症细胞浸润.RAPA-DES组的角膜移植物中无明显水肿,只有少量炎症细胞积累.RT-qPCR结果显示,RAPA-DES组小鼠角膜组织中TNF-α mRNA表达水平与PBS组无明显差异(P>0.05),RAPA-DES 组 IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA表达水平明显低于PBS组和DES组(P<0.05),RAPA-DES组小鼠角膜组织中IL-12α和IL-17α mRNA表达水平低于PBS组(P<0.05).WB结果显示,RAPA-DES组的IL-6和IL-17α蛋白的表达水平明显低于PBS组(P<0.05).结论 RAPA-DES滴眼液能显著延长角膜移植物生存时间,其可以通过降低角膜组织中促炎因子水平,抑制术后角膜移植物炎症反应,从而起到抑制免疫排斥反应的作用.