查看更多>>摘要：[目的]以胡桃楸雄花序为材料,建立染色体形态良好、染色体分散且无细胞质背景的胡桃楸高质量染色体制片技术,为深入开展胡桃楸分子细胞遗传学研究提供参考.[方法]通过卡宝品红压片观察花药发育进程,采集花药细胞处于分裂旺盛阶段的雄花序,分别采用 1 MPa一氧化二氮(N2O,笑气)、0.7 mmol·L-1 环己酰胺、2 mmol·L-1 8-羟基喹啉对花序进行不同时间预处理.剥开花序取出花药,酶解后制成悬液,在 55℃的烤片机上涂片.以 45S rDNA和 5S rDNA为探针,对中期染色体进行原位杂交.[结果]1)当雄花序颜色鲜绿、长度达到约1.5 cm、花药顶端变为红色时,花药细胞分裂旺盛,可以观察到大量小孢子母细胞和中期分裂相.因此,为了获得丰富的有丝分裂中期分裂相,取材最佳时机是雄花序中上部的花药顶端变红时,可以保证雄花序中大部分花药处于旺盛分裂期.2)2 mmol·L-1 8-羟基喹啉预处理 4、6、8 h的染色体都均凝缩不充分,边缘不清晰,拖尾明显,且大部分着丝粒无法辨认;0.7 mmol·L-1 环己酰胺预处理 4 h的染色体较长,凝缩不充分,拖尾严重,预处理 6 h的染色体凝缩适当,形态清晰,大部分着丝粒可以辨认,预处理 8 h的染色体边缘清晰,但凝缩过度,着丝粒不明显;1 MPa N2O预处理 2 h的染色体长度适中,但凝缩不充分,边缘模糊,处理 3、4 h的染色体凝缩程度都较高,染色体较为粗短,染色体间形态差异不明显;此外,N2O预处理 4 h的染色体中,有部分会出现粘连拉丝的情况.因此,胡桃楸雄花序最合适的预处理条件为 0.7 mmol·L-1 环己酰胺处理 6 h.3)胡桃楸染色体数为 32,染色体基数为 16(2n=2x=32).45S rDNA和 5S rDNA探针在胡桃楸染色体上均产生明亮的FISH信号.45S rDNA的杂交信号位于 1对中着丝粒染色体的着丝粒附近,2条染色体上的信号强度相近;5S rDNA的杂交信号位于另外 1对中着丝粒染色体的着丝粒附近,2条染色体上的信号强度一强一弱.[结论]以胡桃楸花药顶端变红的雄花序为材料,成功建立胡桃楸高质量中期染色体制备及FISH技术体系,为核桃属植物的分子细胞遗传学研究奠定基础,也为花药量大的植物获取高质量染色体制片提供了参考.
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