查看更多>>摘要:目的 探讨温肾通络止痛方调控巨噬细胞衰老对老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis,SOP)的干预作用.方法 利用过氧化氢制备衰老巨噬细胞模型并随机分为对照组、模型组、含药血清低剂量组、含药血清高剂量组.β-半乳糖苷酶染色以及qPCR、Western blot检测衰老指标p21 和p53 的mRNA及蛋白表达水平,探讨含药血清对巨噬细胞衰老的影响.使用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)染色和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测巨噬细胞线粒体功能.qPCR检测巨噬细胞极化相关分子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、CD206、一氧化氮合酶(Inducible nitric ox-ide synthase,iNOS)的mRNA水平,免疫荧光检测巨噬细胞极化相关分子精氨酸酶(Arginase,ARG1)和iNOS的蛋白表达,评估含药血清对巨噬细胞极化的影响.qPCR检测成骨相关指标骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ α 1,Col1a1)、Runt相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的mRNA水平以及ALP染色和茜素红染色,评估含药血清处理的巨噬细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)成骨分化的影响.将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、温肾通络止痛方低剂量组、温肾通络止痛方高剂量组,D-半乳糖制备SOP小鼠模型.Micro-CT分析小鼠股骨微结构,HE染色检测小鼠股骨病理变化,Western blot检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53 和成骨相关指标OCN、Runx2 蛋白表达水平,qPCR检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53 mRNA和巨噬细胞极化相关分子IL-6、iNOS、CD206、IL-10 mRNA的表达水平,评估温肾通络止痛方对小鼠SOP模型的影响.结果 与模型组相比,温肾通络止痛方含药血清干预后,衰老阳性细胞数量明显减少,p21 和p53 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001).此外,含药血清可显著抑制H2 O2 诱导的巨噬细胞ROS的产生(P<0.05,P<0.001)、线粒体膜电位下降(P<0.05).含药血清处理后,巨噬细胞M1 相关基因iNOS的mRNA表达下调(P<0.01),M2 相关基因CD163 和CD206 mRNA表达上调(P<0.05),iNOS荧光强度显著降低(P<0.01),ARG1 的荧光强度显著增加(P<0.05).含药血清处理的巨噬细胞条件培养基可增加ALP阳性细胞数(P<0.01,P<0.001)、茜素红阳性面积(P<0.05),以及升高成骨相关基因Runx2、Col1a1 和OCN mRNA表达(P<0.05,P<0.01).Micro-CT结果显示,与模型组相比,温肾通络止痛方组小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),Tb.Sp显著降低(P<0.05,P<0.01);HE结果显示,骨小梁明显改善,数量增多变宽.此外,温肾通络止痛方可显著抑制D-半乳糖诱导的小鼠胫骨衰老相关基因p21 和p53 mRNA和蛋白上调(P<0.05,P<0.001,P<0.000 1),促进成骨相关指标OCN、Runx2 蛋白表达(P<0.01,P<0.000 1),促进M1 相关基因IL-6 和iNOS下调(P<0.05),同时可促进M2 相关基因IL-10和CD206 表达(P<0.05,P<0.01).结论 温肾通络止痛方可能通过抑制巨噬细胞衰老,促进BMSC成骨分化,从而发挥抗骨质疏松效应.