查看更多>>摘要：猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)是一种新发现的猪细小病毒,可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍,严重威胁养猪业健康发展.为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法,本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virion protein,VP1)(348～675 aa)的编码基因为目标片段,构建原核表达载体pET30a-PPV6-VP1,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好的反应原性的重组VP1蛋白,大小约为40 kD.基于纯化的重组VP1蛋白建立间接ELISA抗体检测方法,优化出最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,HRP-兔抗猪IgG稀释比例为1∶60 000,阳性临界值OD450＞0.62.该间接ELISA检测方法与猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、PPV1阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶3 200,批内变异系数和批间变异系数均＜10%,与病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)结果呈正相关,与Western blot结果的阳性符合率为96.6%,表明该间接ELISA检测方法拥有良好的特异性、敏感性、重复性和符合率.采用建立的间接ELISA方法对2018～2022年中国西部地区部分省份收集的452份猪血清进行检测,结果显示样品阳性率为5.31%,表明该病在我国西部地区存在不同程度的感染.本研究成功截短表达了PPV6 VP1(348～675 aa)蛋白,建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PPV6间接ELISA方法,为PPV6的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料.
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