查看更多>>摘要:目的 探讨SH-SY5Y细胞中果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)调控胶质细胞源性神经营养因子受体(glial cell linederived neurotrophic factor receptor,GFR)α1启动子DNA甲基化的分子机制.方法 SH-SY5Y细胞中EZH2及DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)3B过表达及干扰后,采用实时定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测EZH2、DNMT3B、GFRα1 表达水平,染色质免疫共沉淀qPCR检测转染各组DNMT3B启动子区EZH2结合水平及组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)甲基化水平,亚硫酸氢盐测序检测转染各组GFRα1启动子DNA甲基化的程度.采用独立样本t检验比较两组间差异;多组数据的组内比较使用one-way ANOVA分析,并使用LSD-t检验进行两两比较.结果 qRT-PCR及蛋白质印迹法显示,EZH2过表达组EZH2的mRNA及蛋白相对表达量高于过表达对照组,EZH2干扰组EZH2的mRNA及蛋白相对表达量低于干扰对照组(均P<0.05);DNMT3B过表达组DNMT3B的mRNA及蛋白的相对表达量高于过表达对照组;DNMT3B干扰组DNMT3B的mRNA及蛋白的相对表达量低于干扰对照组(均P<0.05).染色质免疫共沉淀qPCR显示,EZH2过表达组DNMT3B启动子区EZH2结合水平为2.25±0.15,高于过表达对照组的1.00±0.05(t=-12.82,P=0.006);EZH2过表达组DNMT3B启动子区H3K27甲基化水平为2.47±0.44,高于过表达对照组的 1.01±0.09(t=-6.17,P=0.025).EZH2干扰组DNMT3B启动子区EZH2结合水平为0.57±0.08,低于干扰对照组的1.00±0.06(t=5.80,P=0.029);EZH2干扰组DNMT3B启动子区H3K27甲基化水平为0.31±0.09,低于干扰对照组的1.08±0.17(t=12.24,P=0.007).qRT-PCR及蛋白质印迹法显示,EZH2过表达组DNMT3B的mRNA相对表达水平为0.58±0.09,低于过表达对照组的1.01±0.13(t=17.75,P=0.003);EZH2过表达组DNMT3B的蛋白质相对表达水平为0.32±0.06,低于过表达对照组的0.54±0.05(t=23.64,P=0.002).EZH2干扰组DNMT3B的mRNA相对表达水平为1.79±0.05,高于干扰对照组的1.01±0.1(t=-12.00,P=0.007);EZH2干扰组DNMT3B的蛋白质相对表达水平为0.85±0.08,高于干扰对照组的0.51± 0.07(t=-18.78,P=0.003).亚硫酸氢盐测序结果显示,EZH2过表达组GFRα1启动子区DNA甲基化水平为0.28±0.03,低于过表达对照组的0.52±0.01(t=8.93,P=0.012);EZH2干扰组GFRα1启动子区DNA甲基化水平为0.79±0.02,高于干扰对照组的0.52±0.01(t=-44.45,P=0.001).qRT-PCR结果显示,EZH2过表达组GFRα1 mRNA相对表达量为1.87±0.05,高于过表达对照组的1.01±0.14(t=-10.04,P=0.001);EZH2过表达+DNMT3B过表达组 GFRα1 mRNA相对表达量为0.73±0.04,低于过表达对照组1.01±0.14(t=3.27,P=0.031);EZH2过表达+DNMT3B过表达组GFRα1 mRNA 相对表达水平为 0.73±0.04,低于 EZH2 过表达组的 1.87±0.05(t=30.00,P=0.001).蛋白质印迹法显示,EZH2过表达组GFRα1蛋白相对表达量为0.89±0.07,高于过表达对照组的0.59±0.03(t=-7.09,P=0.002);EZH2过表达+DNMT3B过表达组GFRα1蛋白相对表达量为 0.48±0.03,低于过表达对照组的 0.59±0.03(t=3.51,P=0.025);EZH2过表达+DNMT3B 过表达组GFRα1蛋白相对表达水平为0.48±0.03,低于EZH2过表达组的0.89±0.07(t=8.84,P=0.001).qRT-PCR结果显示,EZH2干扰组GFRα1 mRNA相对表达量为0.57±0.13,低于干扰对照组的 1.03±0.13(t=4.29,P=0.013);EZH2 干扰+DNMT3B 干扰组 GFRα1 mRNA 相对表达量为1.59±0.06,高于干扰对照组 1.03±0.13(t=-6.67,P=0.003);EZH2 干扰+DNMT3B 干扰组GFRα1 mRNA相对表达水平为1.59±0.06,高于EZH2干扰组的0.57±0.13(t=-12.60,P=0.001).蛋白质印迹法结果显示,EZH2干扰组GFRα1蛋白相对表达量为0.28±0.05,低于干扰对照组的0.58±0.04(t=7.59,P=0.002);EZH2干扰+DNMT3B干扰组GFRα1蛋白相对表达量为0.79±0.07,高于干扰对照组 0.58±0.04(t=-4.19,P=0.014);EZH2 干扰+DNMT3B 干扰组GFRα1 蛋白相对表达水平为0.79±0.07,高于EZH2干扰组的0.28±0.05(t=-9.78,P=0.001).结论 SH-SY5Y细胞中EZH2通过抑制DNMT3B的表达,下调GFRα1启动子区DNA甲基化,进而上调GFRα1的表达.