查看更多>>摘要:目的 探讨微小RNA-486(miR-486)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内皮间质转化(End MT)的影响及其调控机制.方法 常规培养HUVECs,并转染miR-486模拟物(mimic)及阴性对照(NC)质粒,实时荧光定量PCR测定miR-486表达;Western blot检测血管内皮细胞钙黏蛋白(VE Cadherin)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、纤连蛋白(FN)表达;免疫荧光染色检测细胞中CD31与α-SMA表达;Western blot检测磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路相关蛋白表达.使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002与miR-486 mimic共作用于HUVECs,Western blot检测VE Cadherin、Collagen Ⅲ、CD31、α-SMA、FSP1、FN、PTEN及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达.通过生物信息学在线软件预测miR-486与PTEN的靶向结合位点,构建PTEN 3'UTR野生型(WT)及突变型(MUT)质粒载体,双荧光素酶报告基因实验检测miR-486对PTEN的靶向作用.结果 与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中miR-486表达升高(P<0.05),VE Cadherin、CD31表达降低(P<0.05),Collagen Ⅲ、α-SMA、FN表达升高(P<0.05),FSP1表达未发生变化(P>0.05).免疫荧光结果显示,与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中CD31表达明显减弱(P<0.05),α-SMA表达明显增强(P<0.05);与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中PTEN蛋白表达显著降低(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05).与miR-486 mimic组比较,miR-486 mimic+ LY294002组PTEN蛋白表达显著升高(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05).与miR-486 mimic组比较,miR-486 mimic+LY294002组VE Cadherin、CD31表达显著升高(P<0.05),且Collagen Ⅲ、α-SMA、FN表达显著降低(P<0.05),FSP1表达未发生变化(P>0.05).双荧光素酶报告基因分析结果显示,与转染miR-486 NC比较,转染miR-486 mimic能够有效抑制含PTEN原序列的PTEN WT 3'UTR的荧光素酶活性(P<0.05),而对敲除了结合位点的PTEN MUT 3'UTR则无明显抑制作用(P>0.05).结论 miR-486通过抑制PTEN表达促进HUVECs的End MT进程,该机制与激活PI3K/AKT信号通路有关.