查看更多>>摘要：[背景]轮状病毒(Rotavirus,RV)是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一,在公共卫生中具有重要意义.猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)引起的一种急性肠道传染病,常造成仔猪消化道功能紊乱,引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状,一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失.目前,针对PoRV感染尚无特效药物治疗,疫苗接种是控制感染的最经济的途径.然而,PoRV 基因型多且易变异,不同基因型之间的交叉保护很不理想.因此,亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究,探索新型防控策略.[目的]利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体,为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段.[方法]将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后,克隆到pCold-sumo载体中.将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得重组蛋白.利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况.对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后,采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔,每隔 14 d加强免疫一次,经过 3 次免疫后制备多克隆抗体.采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光(IFA)和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性.再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中 3 个非结构蛋白的动态表达,以及鉴定 3 个重组真核质粒转染的效果.[结果]NSP2、NSP4 和 NSP5 重组菌能够有效表达目的蛋白,SDS-PAGE 分析可在目标位置清晰观察到明显条带,并且目的蛋白以可溶性形式存在.3 个重组蛋白制备的多克隆抗体,ELISA效价均超过 1﹕81 000,表明重组蛋白免疫原性良好.IFA结果表明 3 个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应,与其他常见腹泻病原无反应.Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5 多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定.而NSP2 多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2 蛋白的表达,但特异性检测到NSP2 重组质粒转染后的 NSP2 蛋白表达,这一结果可能与 NSP2 的表达特性有关,有待进一步研究确认.随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性.[结论]成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4 和NSP5 非结构蛋白,并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体,为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础.
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