查看更多>>摘要：[背景]肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础,在哺乳动物肌肉中,将近一半的肌肉为骨骼肌,骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合,逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束.在机体内,骨骼肌不仅参与动物生长,也参与呼吸、代谢等生理活动.目前许多研究表明,lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用,是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子.但由于lncRNA作用机制复杂,方式多样,在物种间保守型很低,故不同种属动物lncRNA之间作用关系不大,且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内,而对牛肌肉生长影响的研究内容极少.近年来,人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用,进而调控肌肉细胞的发生过程.[目的]在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉,进行高通量测序,获得高表达差异的1 ncRNA,在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上,探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系,以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响,以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考.[方法]前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用,且对其分化具有负调控作用.为了进一步探究lnc721对牛肌肉发育的调控通路.分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了 3个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组,与3个对照组采用NGS技术进行转录组测序,以期获得lnc721差异靶基因,进一步研究lnc721对牛骨骼肌发育的调控通路.根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果,试验选取MMP9作为lnc721的靶基因,并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测.设计并合成lnc721及MMP9干扰序列,转染至牛骨骼肌卫星细胞中,通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响.并且通过下调MMP9,采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况,以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响.[结果]CatRAPID结果显示,lnc721与MMP9结合倾向为0.75,共有9个结合位点,二者存在互作结合.干扰lnc721之后,采用qRT-PCR分析,结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达(P＜0.01),而在分化期则极显著促进MMP9的表达(P＜0.01),证实了 MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因.进而下调MMP9,检测对增殖期细胞的影响,发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调(P＜0.01),Pax7蛋白表达量显著上调(P＜0.05),EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高.同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响,发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成,同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P＜0.01),MyoG蛋白表达量显著下调(P＜0.05).[结论]lnc721与MMP9相互结合.在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达,而在分化期促进MMP9的表达,且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化.证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育.
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