查看更多>>摘要:目的 研制检测基孔肯雅热免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快检试剂盒,为流行病学调查及实验室诊断提供新的工具.方法 以基孔肯雅病毒特异性原核表达抗原pMal-chik23为诊断抗原,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗IgG二抗为显色抗体,正交实验对诊断抗原、待检血清、二抗工作浓度进行优化,并对包被、封闭、孵育及显色等反应条件进行系统优化,在临床大样品评估的基础上,确定ELISA检测的临界值.在此基础上,对ELISA反应的特异性、灵敏性及稳定性进行评估,研制组装检测基孔肯雅热IgG抗体的ELISA快检试剂盒.结果 经系统优化,研制、组装了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,其最佳反应条件为:1.0 μg/mL包被抗原经碳酸盐缓冲液4 ℃包被24h,HBV封闭液37℃封闭4 h,待检样品1:101稀释后,100μL/孔,37℃反应40 min,磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween 20,PBST)洗涤4次,HRP标记兔抗人IgG 1∶20 000、HRP标记羊抗鼠IgG 1∶10 000稀释后,100 μL/孔,37℃反应30 min,PBST洗涤5次,TMB显色液 100 μL,37 ℃显色 10 min,50 μL 20%H2SO4终止反应,双波长450/630 nm测定 A450 nm值.试剂盒性能评估结果表明,所研制试剂盒与所试阳性样品检测A450 nm值>0.43,阴性样品检测A450nm值<0.04,S/N比值>10,与辛德毕斯、盖塔、罗斯河、登革等9种其他相近虫媒病毒均无交叉反应,并具较高稳定性,板内变异系数为0.76%~2.12%,板间变异系数为0.64%~1.85%,批间变异系数为0.83%~2.31%,均小于3%,4℃保存1年性能无明显下降.结论 研制了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,具备良好的灵敏性、特异性与稳定性.