查看更多>>摘要：TRIM32(tripartite motif protein 32)在细胞分化和增殖过程中发挥重要作用,并且参与了多种生物学过程,包括信号转导、细胞凋亡和基因表达调控等.本课题组前期研究发现,TRIM32基因敲除小鼠对甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)不易成瘾,但具体机制尚不清楚.本研究旨在探讨siRNA(small interfering RNA)转染沉默TRIM32基因对甲基苯丙胺成瘾致神经细胞凋亡的影响及其机制.本文以PC12细胞为研究对象,利用siRNA转染技术沉默TRIM32基因的表达,建立分组:正常对照组,MA处理组,沉默TRIM32组,沉默TRIM32+MA处理组.采用原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL 染色)检测各组细胞的凋亡情况,结果显示,沉默TRIM32+MA处理组细胞较MA处理组凋亡比例下降(P＜0.01),说明沉默TRIM32基因可以抑制MA诱导的细胞凋亡.采用线粒体膜电位试剂盒检测各组线粒体膜电位的变化,结果显示,沉默TRIM32+MA处理组细胞较MA处理组线粒体膜电位升高(P＜0.05),表明沉默TRIM32基因可以调节MA诱导的线粒体膜电位的降低.细胞免疫荧光和West-ern 印迹结果显示,沉默TRIM32+MA处理组较MA处理组胱天蛋白酶-3(caspase-3)、剪切胱天蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)和细胞色素C(Cytochrome c,Cyt-C)蛋白质水平显著下调(P＜0.01),磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化蛋白质激酶 B(phospho-protein kinase B,p-AKT)显著上调(P＜0.01),说明沉默TRIM32基因抑制细胞凋亡可能通过调控PI3K/AKT信号通路来实现.在此基础上深入研究,实验中加入PI3K/AKT抑制剂LY294002,Western印迹检测结果证实,LY294002可部分阻断沉默TRIM32基因对细胞凋亡的调控作用(P＜0.05),进一步证实了沉默TRIM32基因通过激活PI3K/AKT信号通路抑制MA诱导的线粒体途径凋亡.综上,沉默TRIM32基因可抑制MA成瘾引发的线粒体凋亡途径,从而发挥神经保护作用,其机制可能与PI3K/AKT信号通路有关.
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