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中国生物制品学杂志
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封多佳

月刊

1004-5503

zgsw1988@163.com

0431-87923344；87910140

130062

长春市西安大路3456号

中国生物制品学杂志/Journal Chinese Journal of BiologicalsCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《中国生物制品学杂志》为中华预防医学会系列杂志，国家卫生部主管，国内外公开发行。本刊为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。优先报道基金项目及各种基金赞助课题的文章，并适当照顾边远地区和基层单位。本刊可承接国内外与生物制品及生物技术产品有关的设备、试剂广告业务，以刊物所具有的最广泛和最有效的传播能力做好客户的产品宣传。
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    反相液相色谱-质谱联用技术对重组腺相关病毒6型衣壳蛋白的表征分析

    郭莹李响张拓史新昌...
    769-774页
    查看更多>>摘要：目的 应用反相液相色谱-质谱(reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry,RPLC-MS)联用技术对重组腺相关病毒6型(recombinant adeno-associated virus 6,rAAV6)载体的衣壳蛋白进行表征分析,包括一级结构和翻译后修饰(post-translational modification,PTM).方法 流动相 A为0.1％二氟乙酸(difluoroacetic acid,DFA)的水溶液;流动相B为0.1％DFA的乙腈溶液;柱温:80 ℃;梯度洗脱10 min(0→10 min,流动相B 15％→45％).ESI-Q-TOF质谱检测设为阳离子模式:质荷比扫描范围400～4000m/z;扫描频率:2 Hz,锥孔电压:80 V;毛细管电压:3.0kV;离子源温度:120 ℃.结果 AAV衣壳蛋白VP1实测相对分子质量为81 255.9,与理论值偏差为8.1 ppm;VP2蛋白实测相对分子质量为66 062.9,与理论值偏差为3.8 ppm;VP3蛋白实测相对分子质量为59 488.6,与理论值偏差为36 ppm.rAAV6酶切后质量肽图分析,样品序列覆盖率为89％,检测到的PTM主要包括脱酰胺、N-末端乙酰化、泛素化、磷酸化等,并未发现糖基化修饰位点.通过串联质谱分析确证了rAAV6衣壳蛋白N-末端和C-末端的序列以及N-末端的PTM.结论 应用RPLC-MS联用技术分析了rAAV6衣壳蛋白的完整相对分子质量,并在肽段水平运用串联质谱深度分析了 rAAV6衣壳蛋白的PTM,对AAV基因治疗制品的质量控制及生产工艺的提高具有一定意义.

    腺相关病毒衣壳蛋白反相液相色谱串联质谱相对分子质量肽图

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    qPCR在重组腺相关病毒产品大片段宿主细胞残留DNA检测中的应用

    王光裕史新昌杨靖清李响...
    775-778,787页
    查看更多>>摘要：目的 考察qPCR法检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)基因治疗产品中大片段宿主细胞残留DNA(host cell residual DNA,HCD)的可行性.方法 提取4种不同血清型rAAV核酸,采用qPCR法对宿主HEK293细胞基因组长末端重复序列(long terminal repeat sequence,LTR)中244和562 bp两个片段序列进行特异性定量,计算HCD在基因组中的占比.结果 可在qPCR法定量限范围内检出4种不同血清型rAAV样品大片段HCD,占比为0.3％～5.4％,且随着检测片段长度增加,占比呈降低趋势.结论 qPCR技术可用于rAAV产品中大片段HCD的检测.

    荧光定量PCR重组重组腺相关病毒基因治疗产品宿主细胞残留DNA

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    汉坦病毒Vero细胞适应株的筛选及鉴定

    管亚博邢坤鹏刘晨阳王颖...
    779-787页
    查看更多>>摘要：目的 探讨汉坦病毒(Hantaan virus,HTNV)PS-6株经乳鼠鼠脑传代后在Vero细胞上的适应性,并筛选出适应Vero细胞的高滴度HTNV.方法 将HTNV PS-6株在乳鼠鼠脑内连续传代培养后,Vero细胞上连续传10代,观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并采用蚀斑法检测病毒感染性滴度,滴度升高后,采用蚀斑克隆纯化筛选单克隆病毒并检测病毒滴度;分别以0.01、0.05、0.1MOI感染Vero细胞后绘制病毒生长曲线;Reed-Muench法计算病毒LD50;Western blot法鉴定病毒特异性;透射电镜观察病毒大小及结构;与HTNV PS-6株全基因组核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析.将筛选出的Vero细胞适应株V-PS-6经腹腔注射10只BALB/c雌性小鼠,濒死时解剖,取心、肝、脾、肾、脑、肺、小肠、肌肉等组织进行免疫组化分析.结果 鼠脑传代毒株对Vero细胞具有较好适应性,初始病毒滴度为1.3 lgPFU/mL,随着传代次数增加,病毒滴度逐渐升高,稳定在7.5～7.9 lgPFU/mL;筛选出的适应株V-PS-6蚀斑边界清晰、圆润、肉眼可见,大小如针尖,LD50为10-7.8,在相对分子质量约50 000处可见特异性蛋白条带,大小与适应前HTNV PS-6株相符;V-PS-6病毒直径为80～210 nm,与HTNV PS-6电镜结构未见明显差异,核苷酸序列同源性为99.39％,氨基酸序列同源性为98.85％;V-PS-6病毒明显分布在小鼠肾脏、肝脏、小肠、后腿肌肉及心脏中.结论 成功筛选出1株可较好适应Vero细胞的高滴度HTNV株,且具有良好的遗传稳定性,为后续HTNV Vero细胞疫苗的研发及相关机制的研究奠定了基础.

    汉坦病毒Vero细胞适应性传代蚀斑法病毒滴度

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    人乳头瘤病毒58型病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

    王文伟蔡蓓蓓楼觉人
    788-794页
    查看更多>>摘要：目的 利用毕赤酵母重组表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后免疫小鼠,检测制备的HPV58 L1 VLPs的免疫原性.方法 构建HPV58 L1多拷贝表达质粒,转化KM71巴斯德毕赤酵母,筛选高表达毕赤酵母工程菌,5 L发酵罐发酵,分离纯化HPV58 L1 VLPs.纯化后的HPV58 L1 VLPs以不同剂量经腹腔免疫雌性BALB/c小鼠80只,4周后采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)评价其免疫效果.结果 HPV58 L1表达质粒经酶切鉴定构建正确,Western blot分析、氨基酸序列测定和透射电镜观察结果显示,HPV58L1蛋白可在毕赤酵母中成功表达并可自发组装成直径约50 nm的VLPs,经离子交换和体积排阻层析纯化,可获得纯度95％以上的HPV58 L1 VLPs.纯化后的HPV58 L1 VLPs在小鼠模型上的ED5.为0.009μg.结论 利用毕赤酵母成功制备了具有良好免疫原性的HPV58 L1 VLPs.

    人乳头瘤病毒病毒样颗粒中和抗体半数有效剂量毕赤酵母

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    新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体结合疫苗的制备及其免疫原性评价

    姚永鹏张子昌许可朱慧...
    795-800页
    查看更多>>摘要：目的 制备新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体(cross-reacting material 197,CRM197)结合疫苗,并评价其免疫原性,以期为流行性脑脊髓膜炎的防控奠定基础.方法 用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)分别将 A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,并以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)作为连接剂与活化多糖通过氰酸酯连接,生成裸露酰肼基的多糖-ADH衍生物,再通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride,DMTMM]与CRM 197生成酰胺键偶联,得到各单价结合物原液,并进行相关检测.将单价结合物原液按一定比例混合后,分别加入3种冻干保护剂(蔗糖溶液、乳糖溶液及蔗糖+甘露醇溶液),经冻干,制备3种ACYW135-CRM197结合疫苗.将制备的疫苗于0、14 d经雄性NIH小鼠背部皮下注射,0.2 mL/只,每组10只,并于初次免疫后21 d,经小鼠颌下静脉采血,分离血清,ELISA法检测特异性抗体水平.结果 A、C、Y、W135-CRM197单价结合物原液的检测结果均符合质量标准.ACYW135-CRM197疫苗成品可与各群多糖抗血清形成明显沉淀线;平均分子量均在1 680 000～5 230 000范围内.3种ACYW135-CRM197结合疫苗的抗A、C、Y、W135群多糖IgG 抗体阳转率均为 100％;ACYW135-CRM197(蔗糖)、ACYW135-CRM197(乳糖)和 ACYW135-CRM197(蔗糖+甘露醇)组比较,差异均无统计学意义(t=0.249～1.157,P均＞0.05).结论 本研究制备了新型ACYW135-CRM197结合疫苗,且该疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性.

    脑膜炎球菌白喉毒素无毒变异体结合疫苗免疫原性

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    冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定

    张秋菊杨雪冯子祎赵博...
    801-805页
    查看更多>>摘要：目的 对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chro-matograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量.方法 将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,I AM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析.结果 冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC 主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59～79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6～12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20～36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40％～64.31％之间.参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da.结论 冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物.

    狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)狂犬病病毒株4aGV体积分子排阻-高效液相色谱蛋白鉴定nanoLC-MS/MS分析疫苗病毒颗粒

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    结核分枝杆菌Ag85B-Fc2a DNA疫苗的免疫原性及免疫保护性评价

    王天松杨媛姚思杨雨欣...
    806-810,816页
    查看更多>>摘要：目的 评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性,以期为该疫苗的研发提供实验依据.方法 将重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a经双酶切和测序鉴定后,转染CHO-K1细胞,采用Western blot法检测融合蛋白Ag85B-Fc2a的表达.将载体pcDNA3.1(+)及重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a经大腿肌内分别注射雌雄C57BL/6J小鼠(对照组及免疫组),每组10只,初次免疫后2周进行加强免疫.初次免疫后14、28及42 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清中IgG抗体效价;初次免疫后42 d,无菌取小鼠脾脏,制备为单细胞悬液,采用流式细胞术检测CD4+及CD8+T细胞比例;初次免疫后42 d,经尾静脉注射M.tb H37Ra,106 CFU/只,攻毒28 d后,断颈处死小鼠,无菌分离小鼠肺脏及脾脏,采用平板法检测左侧肺脏及脾脏荷菌数,金胺O荧光染色法检测右侧肺脏的荷菌情况.结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a构建正确,转染CHO-K1细胞后,可检测到相对分子质量约70 000的融合蛋白Ag85B-Fc2a.初次免后14、28、42 d,免疫组小鼠血清Ag85B特异性IgG抗体效价分别为1∶3 200、1∶12 160、1∶12 800,对照组小鼠血清中均未检测到抗体效价.初次免疫后42 d,对照组及免疫组小鼠脾脏中CD4+T细胞比例分别为(23.61±0.64)％及(26.92±0.80)％,CD8+T细胞比例分别为(14.12±0.87)％及(18.78±0.94)％,差异均有统计学意义(t分别为3.23和3.64,P均＜0.05).M.tb H37Ra感染28 d,对照组及免疫组小鼠左侧肺脏荷菌数分别为(4.73±0.13)及(3.81±0.14)CFU,脾脏荷菌数分别为(5.02±0.19)及(4.30±0.13)CFU,差异均有统计学意义(t分别为4.65和3.12,P均＜0.01);右侧肺脏荷菌情况与左侧一致.结论 Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内可诱导特异性体液及细胞免疫效应,对M.tb H37Ra感染可产生良好的保护力.

    结核分枝杆菌DNA疫苗体液免疫细胞免疫保护力

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    不同软件对吸附无细胞百白破联合疫苗效价检测结果统计的影响

    魏国良朱婧靓沈雪李晶晶...
    811-816页
    查看更多>>摘要：目的 评价3种软件对吸附无细胞百白破联合疫苗效价检测结果统计的影响,以期为日常检测中分析软件的选择提供依据.方法 采用《中国药典》三部(2020版)中规定的方法检测吸附无细胞百白破联合疫苗百日咳、破伤风及白喉效价.应用PLA 3.0、Stati及依据《中国药典》三部(2020版)通则1431编制的Excel计算表3种软件对吸附无细胞百白破联合疫苗效价检测数据进行统计,并计算效价相对值;应用质反应平行线法确定上述数据的95％可信限区间,并计算相对偏差.结果 3种软件统计吸附无细胞百白破联合疫苗百日咳效价相对值为99.16％～100.46％,95％置信区间相对偏差均＜3％;破伤风效价相对值为99.67％～100.46％,95％置信区间相对偏差均＜1％;白喉效价相对值为97.33％～100.03％,95％置信区间上限相对偏差均＜0,但95％置信区间下限相对偏差较大.结论 3种软件可相互替代,其中Stati及通则软件适合部分无审计追踪要求的工作场景,PLA3.0软件适合生物制品企业的质量控制体系应用.

    吸附无细胞百白破联合疫苗效价统计软件

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    亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆外泌体微小RNA差异表达谱分析

    陈倩冯增强谭琳饶彩霞...
    817-823页
    查看更多>>摘要：目的 探讨亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry,MB-P)病毒灭活对血浆外泌体微小RNA(microRNA,miRNA)表达的影响,以期为MB-P病毒灭活血浆的质量控制提供新的参考指标.方法 收集2021年7月-2022年4月采集的健康无偿献血者全血11人份.离心获得血浆,同一人份新鲜血浆分为2份,分别制备为新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma,FFP)和MB-P病毒灭活血浆.采用差速离心法提取血浆中的外泌体,通过透射电子显微镜(transmis-sion electron microscope,TEM)和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)仪对提取的外泌体进行鉴定,并利用芯片技术检测外泌体miRNA的表达谱.采用qRT-PCR法对差异表达的4个miRNA进行验证,生物信息学方法预测差异表达miRNA的靶基因,并对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析.结果 提取的两组囊泡状物质的形态特征及直径大小均符合外泌体特征.与对照组比较,MB-P组血浆外泌体中存在14个差异表达的miRNA,其中6个miRNA表达上调,8个miRNA表达下调.qRT-PCR验证结果与芯片表达趋势一致.差异表达的miRNA靶基因涉及DNA结合、离子结合、催化活性等功能,并参与核酸代谢、生物合成、转录调控等多种生物学过程;富集显著的功能通路与病毒感染性疾病、肿瘤、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等密切相关.结论 MB-P病毒灭活血浆和FFP外泌体miRNA存在差异性表达,血浆外泌体miRNA有望成为MB-P病毒灭活血浆质量评价的潜在参考指标.

    亚甲蓝光化学法新鲜冰冻血浆病原体灭活外泌体微小RNA

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    跨膜蛋白43对脑心肌炎病毒体外增殖的影响

    何振虎赵克学谢晶莹冯若飞...
    824-830页
    查看更多>>摘要：目的 探讨跨膜蛋白43(transmembrane protein 43,TMEM43)在脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)感染过程中的作用.方法 采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)高通量蛋白质组学技术,对EMCV感染的BHK-21细胞进行蛋白质组学分析;采用分子克隆技术构建人源TMEM43重组质粒pCMV-Myc-TMEM43,转染HEK293细胞后,感染EMCV(MOI=3),real-time PCR法检测TMEM43过表达对EMCV体外增殖以及EMCV吸附和进入的影响;RNAi试验筛选最有效干扰序列,转染HEK293细胞后,感染EMCV(MOI=3),real-time PCR法检测TMEM43下调对EMCV体外增殖的影响.结果 EMCV感染的BHK-21细胞TMEM43表达显著增加.重组质粒pCMV-Myc-TMEM43可在HEK293细胞正常表达,TMEM43过表达对EMCV复制有显著促进作用,病毒感染滴度也有一定提高;TMEM43过表达在病毒进入阶段发挥促进作用,而对吸附过程无任何影响.TMEM43下调对EMCV增殖有明显抑制作用.结论 TMEM43促进EMCV复制增殖,主要在病毒进入阶段发挥作用.

    跨膜蛋白43脑心肌炎病毒增殖吸附进入

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