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中国生物制品学杂志
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封多佳

月刊

1004-5503

zgsw1988@163.com

0431-87923344；87910140

130062

长春市西安大路3456号

中国生物制品学杂志/Journal Chinese Journal of BiologicalsCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《中国生物制品学杂志》为中华预防医学会系列杂志，国家卫生部主管，国内外公开发行。本刊为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。优先报道基金项目及各种基金赞助课题的文章，并适当照顾边远地区和基层单位。本刊可承接国内外与生物制品及生物技术产品有关的设备、试剂广告业务，以刊物所具有的最广泛和最有效的传播能力做好客户的产品宣传。
正式出版
收录年代

    腺相关病毒基因治疗产品基因组滴度数字PCR检测方法的建立及验证

    安怡方毕华刘家池魏云欢...
    897-903,910页
    查看更多>>摘要：目的 建立一种广泛用于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)基因治疗产品基因组滴度检测的数字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)法,并进行初步验证.方法 通过对同一批次AAV基因治疗产品进行dPCR检测,优化筛选最佳引物、探针、样品处理方式以及引物、探针浓度;对优化后方法进行专属性、线性、相对准确度、重复性验证,并确定方法的定量限及检测范围.结果 选择NFS-05 vector titer 5.0为引物、探针,引物终浓度为800 nmol/L,探针终浓度为400 nmol/L,样品前处理方式为经Proteinase K消化.建立的方法专属性良好;在3.3× 105～1.3 × 108vg/mL检测范围内,标准曲线相关系数(R2)＞0.999;相对准确度为70％～130％;重复性CV均≤15％;定量限为3.3× 105vg/mL.结论 建立的dPCR法专属性、线性、准确度及重复性良好,可用于NFS-05重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)原液产品基因组滴度的检测.

    数字PCR腺相关病毒基因组滴度基因治疗

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    重组腺相关病毒衣壳蛋白电荷异质性成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

    秦玺裴德宁肖乐史新昌...
    904-910页
    查看更多>>摘要：目的 建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)衣壳蛋白电荷异质性的成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)检测方法,并进行方法验证,以期为rAAV产品的表征研究、质量控制及生产工艺稳定性的监控提供可靠的检测方法.方法 将待测样品经变性处理后,采用紫外荧光检测模式进行iCIEF分析,进样时间设为55 s,电压为1 500 V,聚焦时间为1 min;随后将电压调整至3 000 V,并继续聚焦10 min.激发波长设为280 nm,发射荧光检测曝光时间设为80 s.以rAAV 5型空心颗粒(rAAV-E)为待测样品,验证方法的专属性、精密性、线性范围、准确性及定量限.采用建立的方法检测rAAV 5型实心颗粒(rAAV-F)样品的电荷异质性.结果 rAAV-E样品在pH 6.9～7.1之间呈现2个明显主峰(Peak1和Peak2),空白对照未检测到病毒衣壳蛋白峰;6次重复检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2的pI均值分别为6.91和7.04,RSD均为0.14％,峰面积百分比均值分别为35.6％和55.8％,RSD分别为1.1％和0.4％;3个时间点检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2峰面积百分比的RSD 分别为 3.45％和 3.38％,pI 的RSD分别为0.10％和0.11％;rAAV-E浓度在(4.08～6.12)× 1012vp/mL范围内,与Peak1和Peak2的总峰面积均值呈良好的线性关系,线性回归方程为y=54 888 x-76 556,R2=0.976;80％、100％和120％预期浓度rAAV-E样品2个主峰总峰面积的回收率均在80％～120％范围内;Peak1的定量限为1.02× 1012 vp/mL,Peak2定量限为0.76 × 1012 vp/mL.rAAV-F样品呈现Peak1 和 Peak2外,在酸性区域(pI＜5.85)还观察到明显的额外峰,这是rAAV-F区别于rAAV-E的主要特征,也表明其具有复杂的电荷异质性分布.结论 建立的iCIEF法具有良好的专属性、精密性及准确性,可用于rAAV衣壳蛋白电荷异质性的分析.

    成像毛细管等电聚焦电泳重组腺相关病毒衣壳蛋白电荷异质性

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    严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域蛋白的分泌表达及其免疫原性分析

    童光伟赵大鹏刘丽高宁...
    911-916,931页
    查看更多>>摘要：目的 原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路.方法 扩增SARS-CoV-2 RBD蛋白基因片段,酶切后与pNCMO2表达载体连接,构建重组表达质粒pNC-RBD.将重组原核表达质粒转化入短小芽孢杆菌感受态细胞,扩大培养并降温诱导蛋白表达.利用亲和层析纯化目的蛋白,经氢氧化铝佐剂吸附后经背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,以仅免疫铝佐剂为对照,每组10只.ELISA法检测体液免疫效果,体外增殖试验测定细胞免疫效果,ELISA法测定多种细胞因子的体外分泌,流式细胞术测定细胞分型.结果 重组表达质粒pNC-RBD经菌落PCR及测序证明构建正确.重组蛋白相对分子质量约22 000,可分泌表达.纯化后重组蛋白纯度达95％以上.免疫小鼠后血清结合抗体和中和抗体效价分别可达1∶10000和1∶750左右,均显著高于佐剂组(t分别为2.845和2.528,P均＜0.01);体外可刺激淋巴细胞增殖,并促进IL-1β及IFNγ的分泌;细胞分型试验结果表明促进了CD4+和CD8+T细胞淋巴细胞增殖.结论 成功可溶性表达了SARS-CoV-2 RBD蛋白,其免疫原性良好,为以RBD蛋白为基础研制SARS-CoV-2基因工程疫苗奠定了基础.

    严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域蛋白可溶性表达免疫原性

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    RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较

    刘煜菡张名许丹菡郭伟...
    917-920页
    查看更多>>摘要：目的 比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒(enterovirus,EV)分离培养的敏感性,以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据.方法 收集2019年昆明市某医院确诊手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患者粪便样本60份,分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV,并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对,鉴定EV基因型.结果 共分离获得112株EV,分别属于11 种基因型.其中 RD细胞分离出 26株Echo-11,6株Echo-6和 Echo-30,2株CV-A4和 CV-A10,1 株CV-A6、CV-A 16和 Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出 6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2.结论 RD细胞对大部分EV均敏感,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感.

    肠道病毒细胞敏感性Vero细胞RD细胞KMB-17细胞

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    MDCK细胞悬浮驯化及细胞系的建立与检定

    阮朝列刘伯川雍国胜施锦丽...
    921-931页
    查看更多>>摘要：目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

    MDCK细胞悬浮培养驯化流感疫苗

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    肠道菌群代谢产物氧化三甲胺对肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞NF-κB/MAPK信号通路的影响

    宋月娟杨波冯强生哈小琴...
    932-937页
    查看更多>>摘要：目的 探讨肠道菌群代谢产物氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)对人肾小球系膜细胞HMC和肾小管上皮细胞 HK-2 核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响,为通过肠道菌群治疗和预防肾损伤提供理论依据.方法 用TMAO处理HMC和HK-2细胞,并设未处理或TMAO处理0h对照组,Real-time PCR法检测炎性反应因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β基因mRNA的转录水平,Western blot法检测NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的表达.并用NF-κB抑制剂BAY 11-7082处理HMC和HK-2细胞,验证TMAO的促炎作用.结果 与对照组相比,HMC和HK-2细胞TMAO处理组炎性反应因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA转录水平均明显上升(t=33.349,P=0.001),TMAO对两种细胞有明显的促炎作用;TMAO可激活HMC和HK-2细胞的NF-κB及MAPK信号通路,引起炎性反应,造成对肾脏的损伤.结论 TMAO含量的增高可激活HMC和HK-2细胞NF-κB/MAPK信号通路,刺激两种细胞释放炎性反应因子,从而导致肾损伤的发生和发展.

    氧化三甲胺肾损伤信号通路人肾小球系膜细胞人肾小管上皮细胞

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    转化生长因子-β2在小鼠过敏性气道炎症及重塑中的作用与干预潜能

    严皎白红妹杨旭孙文佳...
    938-944,951页
    查看更多>>摘要：目的 探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)在过敏原引起的哮喘气道炎症和重塑中的作用及其靶向干预的治疗潜能.方法 以呈现TGF-β2肽表位的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)/TGF-β2病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)免疫6只雌性BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中TGF-β2特异的IgG应答,细胞试验检测抗体对TGF-β2活性的中和能力.卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)短期刺激诱导急性气道过敏性炎症,细胞试验检测小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中TGF-β活性水平;ELISA法检测小鼠血清中OVA特异的IgE水平;光学显微镜下进行BALF中炎性细胞总数及分型计数,并用ELISA法检测BALF中细胞因子水平.经OVA慢性刺激诱导气道纤维化,肺组织切片Masson's trichrome检测胶原积累,并用Sircol胶原检测试剂盒进行可溶性胶原含量定量分析.结果 VLPs免疫诱导了TGF-β2特异性IgG应答,抗血清可有效中和TGF-β2活性.小鼠急性气道过敏性炎症模型中,VLPs免疫下调了气道活性TGF-β水平,显著促进了血清中OVA特异性IgE产生,对气道以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润显示抑制作用,显著促进了Th2炎性细胞因子在气道中的积累.慢性肺纤维化模型中,VLPs免疫显著下调了肺组织胶原沉积及可溶性胶原水平.结论 HBcAg/TGF-β2 VLPs免疫是调控TGF-β2作用的有效手段,TGF-β2在过敏原诱导的炎症应答中总体显示抑制作用,但在纤维化中发挥促进作用.

    转化生长因子-β2病毒样颗粒卵清白蛋白气道炎症纤维化哮喘

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    无血清悬浮驯化CHO-K1单克隆细胞株的建立及其表达验证

    谢涛孙青彭秀娥张朝...
    945-951页
    查看更多>>摘要：目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞,筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株,并进行表达验证.方法 采用逐步降低血清含量的方法,将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞;通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding(简称VIPS系统)筛选单克隆,经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数,确定候选克隆;将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒,根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞.结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养,倍增时间为20～24 h;通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯,以0.5 × 106个/mL的细胞密度接种,培养7 d最高细胞密度可达8.27 × 106个/mL,活率不低于80％,平均倍增时间20.31h,能较好地表达外源基因.结论 通过无血清驯化培养,成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株.

    CHO-K1细胞无血清培养细胞驯化单克隆筛选外源蛋白表达

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    GⅡ.2[P16]型诺如病毒P蛋白的可溶表达、纯化及其抗原特性分析

    李攀刘术敏刘晓雅程英杰...
    952-956页
    查看更多>>摘要：目的 获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒(norovirus,NV)P蛋白,并分析其抗原特性.方法 通过优化合成GⅡ.2[P16]型NVP蛋白基因并克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a,转化DH5α感受态细胞,通过对表达菌种的优化,使P蛋白以可溶性形式表达.表达的P蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,采用Western blot法检测纯化蛋白抗原性;体积排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法检测抗原纯度;ELISA法鉴定抗原抗体结合能力.结果 重组BL21 Star(DE3)pLySs工程菌目的蛋白以可溶形式高表达,经亲和层析纯化后,GⅡ.2P蛋白纯度为95.53％,且抗原性较好.结论 用原核表达菌种成功制备了可溶性表达的NVP蛋白,并明确了 P蛋白的抗原性,为GⅡ.2[P16]型NV检测试剂盒和重组亚单位疫苗的研制奠定了基础.

    诺如病毒GⅡ.2[P16]P蛋白可溶性表达

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    诺如病毒P2结构域的原核表达及其抗血清制备

    陈健伟李浩明雪薇王斌...
    957-963,969页
    查看更多>>摘要：目的 应用原核表达系统表达并纯化5种基因型(G Ⅰ.1、G Ⅱ.2、G Ⅱ.3、G Ⅱ.4、G Ⅱ.17)诺如病毒(norovirus,NV)的P2结构域,并制备其抗血清.方法 利用生物信息学方法分析不同基因型NV P2序列保守性,合成P2DNA序列,亚克隆至pET24a载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达.表达的重组P2蛋白纯化后免疫30只雌性BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA法检测抗血清的滴度和交叉反应,Western blot法检测抗血清的特异性,点杂交法分析抗血清对野生病毒的识别与结合能力.结果 表达的重组P2蛋白相对分子质量约15 000,纯度均达90％以上,GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17型P2蛋白表达量分别为60、26.4、19.8、16.3和33.3mg/L.针对5种基因型NV P2抗原的抗血清滴度均达1∶128 000以上,均能很好地识别自身相应的P2抗原,但不与不相关P2抗原相互作用,均不与重组人A组轮状病毒VP7抗原和重组幽门螺杆菌尿酶抗原发生交叉反应,且对野生型NV具有较好的识别与结合能力.结论 利用原核表达系统成功表达并纯化了我国流行的5种基因型NVP2抗原,制备的抗血清滴度较高,特异性良好,为NV快速、现场诊断技术的建立奠定了基础.

    诺如病毒P2蛋白原核表达抗血清

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