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中国生物制品学杂志
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封多佳

月刊

1004-5503

zgsw1988@163.com

0431-87923344；87910140

130062

长春市西安大路3456号

中国生物制品学杂志/Journal Chinese Journal of BiologicalsCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《中国生物制品学杂志》为中华预防医学会系列杂志，国家卫生部主管，国内外公开发行。本刊为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域，如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注重学术性、前沿性和实用性。优先报道基金项目及各种基金赞助课题的文章，并适当照顾边远地区和基层单位。本刊可承接国内外与生物制品及生物技术产品有关的设备、试剂广告业务，以刊物所具有的最广泛和最有效的传播能力做好客户的产品宣传。
正式出版
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    麻疹病毒N蛋白的原核表达、纯化及其兔抗血清的制备

    杨志辉安欢欢吴杰孟胜利...
    1025-1029,1036页
    查看更多>>摘要：目的 原核表达并纯化麻疹病毒(measles virus,MV)核蛋白(N),免疫家兔后制备兔抗MV N抗血清,并鉴定其特异性.方法 以MV-S191疫苗株基因组为模板,PCR扩增N基因3个片段,构建重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2和pGEX-MV-N3,分别转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达N-末端带有GST标签的融合蛋白GST-MV-N1、GST-MV-N2和GST-MV-N3,纯化后,分别与等体积弗氏完全佐剂(初次免疫)、弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合,乳化均匀后各免疫1只雌性家兔,共免疫6次,采集全血,分离血清获得兔抗MV N抗血清,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定其特异性.结果 重组表达质粒 pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2 和pGEX-MV-N3经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;表达的GST-MV-N1和GST-MV-N3融合蛋白相对分子质量分别约42 000和39 000,主要以包涵体形式存在,纯度分别为96％和85％,而上清和沉淀中均未见GST-MV-N2融合蛋白的表达;兔抗MVN3抗血清能特异性识别MV-S191感染细胞后表达的N蛋白,且特异性高于兔抗MV-N1抗血清.结论 成功制备了兔抗MV N抗血清,为重组MV疫苗的研发以及MV结构蛋白抗体的制备提供了技术支持.

    麻疹病毒核蛋白兔抗血清原核表达纯化

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    细胞穿透肽递送的流感病毒M2胞外区通用DNA疫苗在小鼠体内的免疫效力

    刘洪港赵美霞任维岗李军伟...
    1030-1036页
    查看更多>>摘要：目的 设计通用甲型流感病毒DNA疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效力.方法 合成含H1N1、H3N2、H9N2亚型甲型流感病毒M2(3M2e)胞外结构域的DNA序列,克隆至载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-3M2e.将质粒pVAX1-3M2e分别与细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine 多肽复合物(质量分数1∶1)按不同质量分数混合(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8),进行凝胶阻滞试验,以确定DNA与CPPs的正确结合;并通过细胞荧光试验在细胞水平(293T细胞)检测CPPs的递送效率.选择RVG9dR+Protamine递送质粒pVAX1-3M2e经肌内免疫雄性BALB/c小鼠(多肽复合物两种剂量:25 μg pVAX1-3M2e+500 μg多肽复合物、50 µg pVAX1-3M2e+1000 µg多肽复合物,每组8只小鼠),检测通用甲型流感病毒DNA疫苗对3种亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H9N2)的交叉保护作用.结果 DNA与RVG9dR、Protamine、RVG9dR+Protamine的最佳结合比分别为1∶2、1∶2、1∶1;RVG9dR+Protamine在1:20的质量分数下对质粒pVAX1-3M2e具有超强的递送效率;50 µg pVAX1-3M2e+1 000 μg多肽复合物对3种亚型流感病毒攻毒组小鼠的保护率均为100％.结论 由RVG9dR+Prot-amine多肽复合物递送的质粒pVAX1-3M2e在小鼠中提供了针对3种亚型甲型流感病毒的交叉保护.

    甲型流感病毒M2胞外结构域通用DNA疫苗细胞穿透肽交叉保护

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    重组乳酸乳球菌表达呼吸道合胞病毒Pre F的免疫原性分析

    赵同悦高婧袁蕾雷涵...
    1037-1042,1049页
    查看更多>>摘要：目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

    乳酸乳球菌诱导表达呼吸道合胞病毒口服疫苗免疫原性

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    人源R-spondin 2蛋白的生物信息学分析、表达、纯化及活性检测

    耿腾洁许剑锋
    1043-1049页
    查看更多>>摘要：目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

    哺乳动物蛋白表达系统重组人R-spondin2蛋白荧光素酶报告基因Wnt信号通路

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    真核细胞延长因子2基因RNA干扰慢病毒质粒的构建及验证

    张婷婷薛媛朱超段明廷...
    1050-1055页
    查看更多>>摘要：目的 构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据.方法 根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列,将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shR-NA-ZSgreen-Puro,构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3,以空载体作为阴性对照组(shNC).采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增.经酶切及测序验证正确后,将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72h后荧光显微镜观察绿色荧光强度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平,Western blot法检测eEF2蛋白表达水平.结果 eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致.重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达.与shNC组相比,eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低(t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004);sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低(t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011).结论 成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点.

    真核细胞延长因子2乳腺癌细胞RNA干扰慢病毒载体

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    过氧化氢对人卵巢颗粒细胞KGN增殖、自噬及凋亡的影响

    冯光恩朱晓霞贾瑜琦柴蔚然...
    1056-1061,1069页
    查看更多>>摘要：目的 探讨氧化应激对人卵巢颗粒细胞生长发育的影响.方法 体外培养人卵巢颗粒细胞KGN,用不同浓度的过氧化氢(H2O2)处理KGN细胞,采用CCK8法检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞内活性氧族(reactive oxy-gen species,ROS)产生量及细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达水平.结果 随着H2O2浓度的升高,颗粒细胞增殖受到明显抑制,且呈剂量依赖性(F分别为4.906、4.825、4.653、4.614和4.587,P均＜0.001).细胞内ROS水平随着H2O2浓度的增加而升高,同时细胞凋亡率不断升高;加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)后,ROS水平恢复,细胞凋亡率下降,表明细胞凋亡与ROS的产生有关.H2O2处理后,KGN细胞中LC3-Ⅱ、cleaved-caspase3蛋白的表达水平显著升高(t分别为4.809和5.789,P均＜0.05),LC3-Ⅰ、BCL-2、P62蛋白的表达水平显著降低(t分别为4.014、3.982和4.415,P均＜0.05),表明H2O2能够诱导KGN细胞的自噬和凋亡.结论 H2O2能够抑制人卵巢颗粒细胞增殖,诱导其自噬凋亡.氧化应激状态抑制人卵巢颗粒细胞的生长发育,降低卵母细胞质量,卵巢储备功能下降.

    过氧化氢人卵巢颗粒细胞氧化应激

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    结合人血小板裂解液培养人脐带间充质干细胞的基础培养基选择

    王灵娟刘春香蔡光辉芦慧颖...
    1062-1069页
    查看更多>>摘要：目的 结合人血小板裂解液(platelet lysate,PL)选取一种安全性高、成本低、适用于人脐带间充质干细胞(hu-man umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)生长,且在培养过程中不影响细胞各项功能的基础培养基,用于大量高代次hUC-MSC的培养.方法 将MSCBM、α-MEM、IMDM 3种基础培养基分别与PL UltraGROG Advanced进行配比,培养P0～P8代hUC-MSCs,对比不同代次的细胞形态、扩增数量、增殖功能、分化功能及免疫表型,确定适用于HUC-MSCs培养的最佳基础培养基.结果 3种培养基培养的P1～P5代细胞,形态均一,呈放射状生长,与标准的细胞形态相比差异无统计学意义(tIMDMVSα-MEM=0.159,tMSCBMVSα-MEM=0.147,tIMDMVSMSCBM=0.161;P 均＞0.05),培养至P6～P8代时,MSCBM、α-MEM培养的细胞与P0～P5代细胞形态相比,差异无统计学意义(tIMDM VSMSCBM=0.132,tIMDMVSα-MEM=0.128;P均＞0.05);MSCBM、α-MEM、IMDM培养的 P1～P8代细胞阳性表达CD73、CD90、CD105,表达率均约达99％,阴性表达CD34、CD45,表达率均低于2％,不同培养基间差异无统计学意义(tIMDMVSα-MEM=0.102,tMSCBMVSα-MEM=0.106,tIMDMVSMSCBM=0.113;P均＞0.05);3种培养基培养的P8代细胞克隆形成性不同,MSCBM培养的细胞形成的单个克隆团和克隆团内细胞数量均高于α-MEM、IMDM培养的同代次细胞(t分别为0.023、0.049,P均＜0.05);3种培养基培养的细胞增殖功能由高到低分别为MSCBM、α-MEM、IMDM,其中MSCBM显著高于IMDM(t=0.041,P＜0.05),而与α-MEM差异无统计学意义(t=0.211,P＞0.05),倍增时间(DT)与增殖功能结果一致;3种培养基培养的同代次细胞均具有较强分化功能,培养的P8代细胞分化成骨和成软骨的细胞数量无显著差异(tIMDMVSα-MEM=0.119,tMSCBMVSα-MEM=0.112,tIMDMVSMSCBM=0.111;P均＞0.05),MSCBM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于α-MEM培养的P8代细胞(t=0.036,P＜0.05),α-MEM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于IMDM培养的P8代细胞(t=0.031,P＜0.05).结论 确定了最佳hUC-MSCs培养体系为MSMBM添加5％UltraGROG Ad-vanced,其次为α-MEM添加5％UltraGROG Advanced,建议选择此两种无血清培养体系用于MSCs的大规模培养.

    细胞培养培养基血小板裂解液脐带间充质干细胞

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    紫色色杆菌转氨酶基因表达载体的构建及其原核表达

    陈存刘韩翁静凤杨运航...
    1070-1074页
    查看更多>>摘要：目的 利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶(CV2025)基因序列构建重组质粒pET-28a-CV2025,并在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中进行原核表达.方法 将CV2025基因序列与pET-28a(+)载体连接,构建重组质粒pET-28a-CV2025,转化E.coliTOP10中进行阳性克隆子筛选,经双酶切及测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,诱导表达目的蛋白;将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基,IPTG诱导表达制备粗酶液后,以异丙胺为氨基供体,1-(4-甲氧苯基)乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体,采用薄层色谱法监测反应,初步检验转氨酶活性,高效液相色谱法进行进一步分析.结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带,且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在;酶液催化后,1-(4-甲氧苯基)乙酮与异丙胺发生转氨基化反应,生成对应的手性胺1-(4-甲氧苯基)乙胺,具有一定的催化活性.结论 在E.coli中成功表达了CV2025,初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性,为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础.

    紫色色杆菌转氨酶大肠埃希菌基因克隆表达转氨基化反应

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    恩诺沙星对鼠疫耶尔森菌L型的诱导作用

    李朋伟王婷张婷婷孙田华...
    1075-1079页
    查看更多>>摘要：目的 探讨恩诺沙星对鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)L型的诱导作用,以期了解更多鼠疫菌L型的形成条件和生物学特性.方法 将鼠疫菌EV株分别接种于含0、0.5、5、10、50、100、500、1 000ng/mL恩诺沙星的赫氏培养基中培养.将含50ng/mL恩诺沙星的培养物接种于不含恩诺沙星的赫氏培养基中进行返祖培养.观察各样品菌落形态,通过革兰染色和细胞壁染色观察细菌形态,透射电镜观察细胞壁状态.对鼠疫菌EV株和鼠疫菌L型进行16S rDNA鉴定,并进行同源性分析及构建系统发育树.结果 赫氏培养基中含0.5ng/mL恩诺沙星可引起鼠疫菌形态改变,由典型短杆菌变为长杆菌.恩诺沙星浓度为50 ng/mL时鼠疫菌细胞壁缺失,细菌无法正常分裂增殖而呈长杆状,盘绕成团,菌落呈油煎蛋样.恩诺沙星诱导鼠疫菌L型在正常赫氏培养基中可返祖,并表现为短小杆状的典型鼠疫菌形态.16S rDNA鉴定诱导菌与诱导前亲本EV株同源性为100％.结论 恩诺沙星可诱导鼠疫菌形成L型.

    鼠疫耶尔森菌L型细菌恩诺沙星细胞壁

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    RSPO1蛋白的纯化及其免疫淘选

    杜梦阳许剑锋
    1080-1084页
    查看更多>>摘要：目的 通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选.方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMV-Fc,瞬时转染 HEK-293F 细胞,表达 RSPO1 蛋白;经 Protein A 凝胶柱、HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200pg 柱、Super-dexTM 24 Increase10/300GL柱依次纯化RSPO 1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巢式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序.结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确.表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000,纯度约为70％;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2× 108cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列.结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能.

    RSPO1纳米抗体噬菌体展示技术抗体库免疫淘选

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