查看更多>>摘要:目的 探讨 6-姜烯酚(6-SH)是否通过促进微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)表达并抑制死亡相关蛋白激酶 1(DAPK1),减轻氧糖剥夺/复氧(OGD/R)神经细胞自噬及神经细胞钙超载,并探究其潜在机制.方法 取体外培养的对数生长期小鼠海马神经元HT22 细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,寻找Na2S2O4 的最佳制模浓度.将HT22细胞分为空白对照组(NC组)、OGD/R组(无糖培养基+10 mmol/L Na2S2O4 处理 1.5 h后换正常培养基培养 4 h)、6-SH干预组(OGD后用 10 μmol/L 6-SH培养 4h)、阴性对照抑制剂预处理组(阴性对照抑制剂转染48h后行OGD,再用6-SH培养4 h)、miR-26a-5p抑制剂预处理组(miR-26a-5p抑制剂转染 48h后行OGD,再用 6-SH培养 4h).采用CCK-8 法检测各组细胞活性;透射电镜下观察细胞超微结构;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测DAPK1、miR-26a-5p基因表达;分子对接验证 6-SH与miR-26a-5p的相互作用;双荧光素酶验证DAPK1 与miR-26a-5p的靶向关系;流式细胞仪测定细胞内Ca2+水平;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测磷酸化谷氨酸受体 2B(p-NMDAR2B)Ser1303、DAPK1、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白 1 轻链 3(LC3)、p-DAPK1 Ser308 蛋白表达;免疫荧光法检测LC3 和Beclin1的表达.结果 CCK-8 法检测结果显示,6-SH干预组细胞活性较OGD/R组明显升高,miR-26a-5p抑制剂预处理组细胞活性较 6-SH干预组明显降低.透射电镜下显示,6-SH干预组自噬小体较OGD/R组明显减少,miR-26a-5p抑制剂预处理组自噬小体较 6-SH干预组明显增多.RT-qPCR检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组miR-26a-5p表达明显上调,DAPK1 mRNA表达明显下调;与 6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组miR-26a-5p表达明显下调,DAPK1 mRNA表达明显上调.分子对接验证 6-SH与miR-26a-5p可互相作用.双荧光素酶报告基因检测显示,与阴性对照组比较,mmu-miR-26a-5p显著下调m-DAPK1-3UTR-WT的荧光素酶表达,说明两者之间存在结合作用.流式细胞仪检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组细胞内Ca2+水平明显降低;与 6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组Ca2+水平明显升高.Western blotting检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组p-NMDAR2B Ser1303、DAPK1、Beclin1、LC3 蛋白表达均明显降低(p-NMDAR2B Ser1303/β-actin:2.34±0.27 比 4.78±0.39,DAPK1/β-actin:1.40±0.13 比 2.37±0.21,Beclin1/β-actin:2.61±0.32 比 4.32±0.29,LC3/β-actin:2.52±0.45 比 5.09±0.18,均P<0.05),p-DAPK1 Ser308蛋白表达明显升高(p-DAPK1 Ser308/β-actin:0.66±0.09 比 0.40±0.02,P<0.05);与 6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组p-NMDAR2B Ser1303、DAPK1、Beclin1、LC3 蛋白表达明显升高(p-NMDAR2B Ser1303/β-actin:4.08±0.14比2.34±0.27,DAPK1/β-actin:1.96±0.15比1.40±0.13,Beclin1/β-actin:3.92±0.31比2.61±0.32,LC3/β-actin:4.33±0.33比2.52±0.45,均P<0.05),p-DAPK1 Ser308蛋白表达明显降低(p-DAPK1 Ser308/β-actin:0.33±0.12 比 0.66±0.09,P<0.05);免疫荧光法检测显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组LC3、Beclin1 荧光强度明显降低;与 6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组LC3、Beclin1 荧光强度明显升高.结论 6-SH可通过调控miR-26a-5p/DAPK1 减轻细胞自噬及钙超载,从而减轻神经细胞损伤.