查看更多>>摘要:目的 探讨靶向抑制3型脱碘酶(Dio3)对脓毒症骨骼肌线粒体的保护作用及其机制.方法 ①体内实验:通过盲肠结扎穿孔术(CLP)构建脓毒症大鼠模型;利用腺相关病毒靶向干扰大鼠胫骨前肌Dio3的表达.按随机数字表法将雄性SD大鼠分为阴性敲除假手术组(shNC+Sham组)、阳性敲除假手术组(shD3+Sham组)、阴性敲除CLP组(shNC+CLP组)和阳性敲除CLP组(shD3+CLP组),每组8只.制模后取胫骨前肌,用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测Dio3、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC1α)、沉默信息调节因子1(SIRT1)等蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测甲状腺激素受体(THRα、THRβ)、单羧酸转运蛋白10(MCT10)等T3调控基因,线粒体DNA(mtDNA),线粒体生物合成相关基因PGC1α的mRNA表达;透射电镜下观察线粒体形态.②体外实验:体外培养小鼠成肌样细胞C2C12,利用慢病毒干扰Dio3表达,并用脂多糖(LPS)构建内毒素细胞模型,并分为shNC组、shD3组、shNC+LPS组和shD3+LPS组.免疫荧光染色分析PGC1α胞内分布.免疫共沉淀联合Western blotting检测PGC1α乙酰化水平.结果 ①体内实验:与shNC+Sham组相比,shNC+CLP组骨骼肌内Dio3蛋白表达明显升高(Dio3/β-Tubulin:3.32±0.70 比 1.00±0.49,P<0.05),而 shD3+Sham 组无差异;shD3+CLP 组 Dio3 蛋白表达较 shNC+CLP 组明显降低(Dio3/β-Tubulin:1.42±0.54 比 3.32±0.70,P<0.05).与 shNC+CLP 组相比,shD3+CLP 组 T3 调控基因的表达明显上调[THRα mRNA(2-△△Ct):0.67±0.05 比 0.33±0.01,THRβ mRNA(2-△△Ct):0.94±0.05 比0.67±0.02,MCT10 mRNA(2-△△Ct):0.65±0.03 比 0.57±0.02,均 P<0.05].电镜结果提示,shNC+CLP组骨骼肌线粒体损伤明显,而shD3+CLP组线粒体形态保持完整;与shNC+Sham组相比,shNC+CLP组线粒体数量明显减少(个/HP:10.375±1.375 比 13.750±2.063,P<0.05),而 shD3+CLP 组线粒体数量较 shNC+CLP 组明显增多(个/HP:11.250±2.063 比 10.375±1.375,P<0.05);shNC+CLP 组 mtDNA 表达较 shNC+Sham 组明显降低(拷贝数:0.842±0.035 比 1.002±0.064,P<0.05),而 shD3+CLP 组 mtDNA 表达与 shNC+CLP 组无差异,但明显高于 shD3+Sham 组(拷贝数:0.758±0.035 比 0.474±0.050,P<0.05).与 shNC+CLP 组相比,shD3+CLP 组PGC1α的转录及蛋白水平均明显改善[PGC1α mRNA(2-△△Ct):1.49±0.13比0.68±0.06,PGC1α蛋白相对表达量(PGC1α/β-Tubulin):0.76±0.02 比 0.62±0.04,均 P<0.05].②体外实验:LPS 干预 24 h 后,shNC+LPS组PGC1α胞内定位弥散;干扰Dio3表达后促使PGC1α向核周及核内移位.与shNC+LPS组比较,shD3+LPS组PGC1α的乙酰化水平明显降低(乙酰化PGC1α/β-Tubulin:0.59±0.01比1.24±0.01,P<0.05),而介导蛋白去乙酰化的主要蛋白SIRT1的表达明显升高(SIRT1/β-Tubulin:1.04±0.04比0.58±0.03,P<0.05).利用EX527抑制SIRT1 活性后,shD3+LPS+EX527组PGC1α 蛋白表达较shD3+LPS组明显降低(PGC1α/β-Tubulin:0.92±0.03比1.58±0.03,P<0.05).结论 抑制骨骼肌Dio3表达可以通过激活SIRT1减轻PGC1α的乙酰化修饰,促使PGC1α向核内移位,从而对脓毒症导致的骨骼肌线粒体损伤起到保护作用.