查看更多>>摘要:目的 探讨内含子源性27nt-miRNA(27nt-miR)对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换的影响及其分子机制.方法 用27nt-miR表达慢病毒转染培养的VSMCs,观察其对PDGF-BB诱导的VSMCs表型转换的影响;将细胞分为对照组、PDGF-BB诱导组、27nt-miR组、27nt-miR-sponge 组及27nt-miR NC 组(27nt-miR NC 组).雷帕霉素(100 nmol/L)与 MHY-1485(10 μmol/L)作用于 27nt-miR 组、27nt-miR-sponge 组及 27nt-miR NC 组,以验证 27nt-miR 是否参与mTOR与p70S6k通路的调控.用生物信息学预测27nt-miR与mTOR的靶向结合位点,用CCK-8法与EdU法分别测定VSMCs活力与增殖情况,划痕试验测定VSMCs迁移能力,实时荧光聚合酶链反应检测α-SMA、SM22α 及 OPN mRNA 表达,Western blotting 检测 α-SMA、SM22α、OPN、mTOR、p-mTOR、p70S6k 与 p-p70S6k蛋白表达.结果 CCK-8法结果示,PDGF-BB诱导组细胞增殖率较正常值高(P<0.05),27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组比较,差异无统计学意义(P>0.05);27nt-miR组细胞增殖率较27nt-miR NC 组低(P<0.05),27nt-miR-sponge 组与 27nt-miR NC 组比较,差异无统计学意义(P>0.05).PDGF-BB诱导组细胞迁移率较对照组高(P<0.05),27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组比较,差异无统计学意义(P>0.05);27nt-miR组细胞迁移率较27nt-miR NC组低(P<0.05),27nt-miR-sponge组细胞迁移率与27nt-miR NC组比较,差异无统计学意义(P>0.05).EdU法结果示,PDGF-BB诱导组细胞增殖率较对照组高(P<0.05),27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组细胞增殖率比较,差异无统计学意义(P>0.05);27nt-miR 组细胞增 殖率较 27nt-miR NC 组低(P<0.05),27nt-miR-sponge 组与 27nt-miR NC 组比较,差异无统计学意义(P>0.05).PDGF-BB诱导组α-SMA mRNA相对表达量较对照组低(P<0.05),两组SM22α与OPN mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05).27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组α-SMA、SM22α、OPN mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);27nt-miR组α-SMA、SM22α mRNA相对表达量较27nt-miR NC组高(P<0.05),OPN mRNA相对表达量较27nt-miR NC组低(P<0.05);27nt-miR-sponge 组与 27nt-miR NC 组 α-SMA、SM22α mRNA 相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05),27nt-miR-sponge 组 OPN mRNA 相对表达量较 27nt-miR NC 组高(P<0.05).PDGF-BB诱导组α-SMA、SM22α蛋白相对表达量较对照组低(P<0.05);27nt-miR NC组、PDGF-BB诱导组OPN蛋白相对表达量较27nt-miR组高(P<0.05);27nt-miR组α-SMA、SM22α蛋白相对表达量较27nt-miR NC 组高(P<0.05),OPN 蛋白相对表达量较 27nt-miR NC 组低(P<0.05);27nt-miR 组 p70S6k、p-p70S6k与p-mTOR蛋白相对表达量较27nt-miR NC组低(P<0.05);各组经雷帕霉素处理后,27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组各蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05).27nt-miR组p70S6k、p-p70S6k、mTOR、p-mTOR 蛋白 相对表达量较 27nt-miR NC 组低(P<0.05),27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组p-p70S6k、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05).各组经 MHY-1485 处理后,27nt-miR 组 p70S6k、p-p70S6k、mTOR、p-mTOR 蛋白 相对表达量较 27nt-miR NC组低(P<0.05);27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组各蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 27nt-miR可能通过靶向mTOR/p70S6k信号通路从而调节大鼠血管平滑肌细胞增殖活力、增殖、迁移与表型转换.