查看更多>>摘要:目的 探究miR-515-5p抑制骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡、缓解炎症反应的分子机制.方法 体外培养人软骨细胞系C28/I2,使用10ng/mL IL-1β处理细胞24 h构建体外OA模型;另外,分别采用 miR mimics、mimics 阴性对照(negative control,NC)、过表达(over expression,oe)-NC 和 oe-Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)转染C28/I2细胞后,使用10 ng/mL IL-1β处理各组细胞24 h构建OA模型.采用细胞计数试剂盒8和EdU检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测B淋巴细胞瘤 2 蛋白(B-cell lymphoma 2 protion,Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、裂解的半胱天冬酶 3(cleaved-Caspase-3)、TLR4、髓样分化因子 88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)、p65及磷酸化p65(phosphorylated p65,p-p65)蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR检测miR-515-5p、TLR4 mRNA表达水平,ELISA检测细胞上清液中促炎因子前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、TNF-α、IL-6的水平.通过BiBiServ2数据库预测miR-515-5p和TLR4之间的潜在结合位点,并采用双荧光素酶报告实验验证miR-515-5p和TLR4的靶向关系.结果 采用IL-1β处理C28/I2细胞后,miR-515-5p、Bcl-2蛋白的表达及细胞增殖能力均显著降低,Bax和cleaved-Caspase-3蛋白表达水平、细胞上清液中促炎因子(PGE2、TNF-α、IL-6)水平及细胞凋亡率均显著增加;此外,S期和G2期细胞比例显著降低,G1期细胞比例显著增加,提示IL-1β处理后细胞周期受到阻滞.而转染miR mimics后,细胞中miR-515-5p表达水平显著上调,部分逆转了 IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡,缓解了 OA软骨细胞的周期阻滞和炎症反应.采用IL-1β处理C28/I2细胞后,TLR4的mRNA和蛋白水平均显著升高;过表达miR-515-5p后,靶向抑制了 TLR4的表达并且阻断了 MyD88/NF-κB通路的激活.而过表达TLR4可部分逆转miR mimics对IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡及炎症的改善作用.结论 miR-515-5p靶向负调控TLR4的表达,抑制了 MyD88/NF-κB通路激活以及OA软骨细胞凋亡,并有效缓解了细胞炎症反应.