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中国预防兽医学报
中国预防兽医学报

孔宪刚

月刊

1008-0589

zgyfsyxb@vip.sina.com.cn

0451-85935050 18946066050 18946066181

150001

哈尔滨市南岗区马端街427号

中国预防兽医学报/Journal Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊是由国家科技部批准,农业部主管并委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的国家级学术刊物,双月刊,国际标准大16开本,120页。刊号ISSN1008-0589,CN23-1417/S。本刊是中国自然科学核心期刊、中国期刊网入网期刊。中国科学引文数据库来源期刊,中国学术期刊评价数据库来源期刊。国内外公开发行。本刊始终坚持社会主义办刊方向,坚持“面向、依靠、攀高峰”方针,坚持理论与实践相结合,提高与普及相结合,以提高为主的办刊方针,大力提倡学术性、科学性、实用性、创新性、及时报道国内外预防兽医学方面的新进展、新成果、积极开展学术交流,为促进我国兽医科技事业的发展和畜禽疫病水平的提高,为加速科技成果的转化做出了重大贡献。
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收录年代

    伪狂犬病病毒在小鼠原代神经细胞中潜伏感染模型的建立

    向广韬吴红霞王异民周末...
    1-6,15页
    查看更多>>摘要:缺少PRV良好的潜伏感染模型已成为研究其潜伏感染机制的障碍.为建立PRV潜伏感染的体外细胞模型,本研究通过分离新生鼠背根神经节(DRG)获取神经细胞,并利用间接免疫荧光试验(IFA)对其进行鉴定,获得了DRG中的神经细胞.采用重组报告病毒rPRV-EGFP感染神经细胞,同时添加阿昔洛韦(ACV)抑制病毒复制以建立潜伏感染,并采用棋盘法对病毒感染剂量和ACV浓度进行优化,结果显示,感染复数(MOI)为0.001,ACV浓度为0.5 mmol/L,病毒能够在神经细胞中稳定建立潜伏感染.采用荧光定量RT-PCR、病毒滴度测定、药物刺激再激活的方法对潜伏感染模型鉴定,结果显示,潜伏感染时病毒不能复制,且不产生感染性病毒粒子;而经LY294002(PI3K抑制剂)诱导病毒再激活后,病毒大量复制并产生感染性病毒粒子.本研究首次利用小鼠原代神经细胞建立了PRV的潜伏感染模型,该模型的建立为PRV潜伏感染机制的研究奠定了基础.

    伪狂犬病毒小鼠背根神经节潜伏感染再激活模型

    一株猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

    周龙玉祝瑶林龙华柴霁芸...
    7-15页
    查看更多>>摘要:为确定黑龙江省某养殖场因呼吸道症状急性死亡病猪的致病菌,并探究其主要生物学特性,本研究采集病死猪内脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA基因的PCR扩增、测序、系统进化树的构建对分离菌进行种属鉴定;通过微量肉汤稀释法分析该菌对8类10种抗生素的敏感性;通过Illumina PE150对细菌全基因组测序,采用ResFinder软件分析分离菌的耐药基因,并分析耐药基因与耐药表型的相关性.利用VFanalyzer软件、BLASTN比对分离菌的毒力基因.结果显示,该菌株在10%脱纤维羊血平板培养基上培养24 h后形成表面光滑具有β-溶血环的单菌落;革兰氏染色结果显示呈蓝紫色短棒状杆菌;生化鉴定结果显示该分离菌的生化特性与化脓隐秘杆菌符合.16S rRNA基因的PCR结果显示,扩增到1 397 bp的目的基因序列,与GenBank中序列比对结果显示该菌株与已报道的化脓隐秘杆菌同源性高达99%.16S rRNA基因系统进化树分析结果显示分离菌与辽宁沈阳的牛源化脓隐秘杆株TZQ 01株处于同一分支,与日本的猪源分离株NIAH13531处于较近分支,以上结果可确定该分离菌为化脓隐秘杆菌,并将其命名为FY-4-Z-1.药敏试验结果显示,该菌株对头孢菌素类的头孢噻呋,青霉素类的青霉素、阿莫西林,大环内酯类的红霉素,截短侧耳素类的泰妙菌素等抗生素敏感,对四环素类的四环素,氨基糖苷类的链霉素耐药.利用组装软件SPAdes对获得的全基因组测序数据组装后获得了分离菌全基因组草图,结果显示分离菌基因组大小为2 399.961 kb;耐药基因分析结果显示,该菌株基因组包含3种耐药基因,分别是氨基糖苷类的ant(6)-la、大环内脂类的erm(X)、四环素类的tet(W)耐药基因,其中在化脓隐秘杆菌中首次检测到ant(6)-la基因.该菌株对四环素和链霉素的药敏试验结果与其耐药基因检测结果相符,而红霉素敏感表型可能与其耐药基因erm(X)的移码突变有关.利用BLASTN和VFanalyzer软件进行毒力基因检测,结果显示共检测到8个已知毒力基因和24个候选毒力相关基因.本实验进一步丰富了猪源化脓隐秘杆菌的相关研究,为规模化猪场化脓隐秘杆菌病的防治提供了重要的参考依据和用药指导.

    化脓隐秘杆菌生物学特性药敏试验耐药基因毒力基因

    2018年~2021年河北省部分地区鸡源沙门菌的生物学特性及致病性研究

    李涵赵允清谢相悦庄洪霞...
    16-23,31页
    查看更多>>摘要:为调查河北地区鸡源沙门菌及其血清型的流行及分布情况,并分析其的致病性,本研究于2018年~2021年在河北省7个地区34个养鸡场共收集631份发病鸡肛拭子和62份病料样品共计693份,分别接种普通琼脂培养基分离细菌并纯化后经革兰氏染色镜检;将分离菌分别接种不同的培养基培养,并对分离菌经生化及16S rRNA基因的PCR及测序鉴定,随机选择32条测序序列经NCBI的BLAST比对,并采用DNAStar软件分析该基因的同源性.采用玻片凝集法鉴定分离菌的血清群及血清型并统计各血清群与血清型在河北不同地区的分布.结果显示,从693份病料样品中共分离到238株沙门菌,除3株未定群外,其余分离菌分属于A、B、C、D、E、F 6个血清群,其中D群最多达69.7%(166/238);238株沙门菌分属于7个不同的血清型和未定型,依次为鸡白痢沙门菌(91/38.2%)、甲型副伤寒沙门菌(43/18.0%)、鸡伤寒沙门菌(40/16.8%)、肠炎沙门菌(39/16.4%)等.血清群与血清型分布的统计结果显示,除张家口地区流行A群血清群外,其余地区流行的血清群均为D群;张家口地区流行鸡白痢沙门菌;秦皇岛地区有14种血清型,其中甲型副伤寒沙门菌为其流行血清型;石家庄、承德、唐山流行的均为鸡白痢沙门菌,邢台及保定地区分别流行肠炎沙门菌与鸡伤寒沙门菌.通过K-B药敏纸片法检测238株分离菌对7类共22种药物的敏感性;采用PCR检测分离菌的相关耐药基因并采用SPSS26.0软件中的Fisher确切概率法分析分离菌耐药表型与耐药基因之间的相关性.选取12株不同血清型的分离菌以0.2 mL/只(3×108 cfu/mL)感染雏鸡,分析各分离菌对雏鸡的致病性.药敏试验结果显示,对苯唑西林、红霉素、青霉素、甲氧苄啶、氨苄西林、四环素耐药的菌株分别占97.5(232/238)、89.1%(212/238)、78.6%(187/238)、74.8%(178/238)、74.4%(177/238)、64.3%(153/238),对其它药物耐药的菌株均在32%以下,但均对头孢类药物敏感;且分离菌多呈多重耐药性(58.4%,139/238),耐6重药物的菌株(32.8%,78/238)与耐5重药物的菌株(11.8%,28/238)最多.耐药基因检测结果显示,对β-内酰胺类、磺胺类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类药物的耐药基因tem、erm(B)a、tetA、strA-B的检出率分别为100%(238/238)、75.2%(178/238)、71%(169/238)、65.6%(156/238)及31.9%(76/238).未检测到喹诺酮类和醛胺醇类耐药基因.经分析,氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类药物的耐药表型与其耐药基因的符合率分别为94.7%、98.1%、99.4%、97.5%、79.9%,相关性均较强.致病性试验结果显示,12株分离菌均能致感染鸡出现不同的临床症状及肝脏和肠道的剖检病变,且能对鸡造成不同程度的死亡,其中以致鸡死亡10只(100%)、7只(87%)为主,并从死亡鸡的肝脏再次分离到相应细菌.上述结果表明,本研究从河北不同地区分离的238株沙门菌血清群与血清型众多,大多数沙门菌的耐药性较强且多呈多重耐药性,其携带的5类药物的耐药基因与其相对应的耐药表型均呈较强的相关性,且分离菌对雏鸡呈不同的致病性.本研究为河北地区鸡源沙门菌的流行病学调查及其感染的防治提供参考依据.

    鸡源沙门菌血清型鉴定药物敏感性试验耐药基因耐药性分析

    冀北地区致犊牛腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性研究

    张召兴韩平王亚男王珍珊...
    24-31页
    查看更多>>摘要:为鉴定冀北地区养殖场中引起犊牛腹泻的病原菌,本实验于2021年~2023年采集冀北地区养殖场中患腹泻病奶\肉犊牛的肛拭子、粪便及肝脏等病料样品247份,采用细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定和ureR基因的PCR扩增等方法进行细菌的分离鉴定,结果显示,从采集的247份患腹泻病的奶\肉犊牛病料样品中分离并鉴定到102株奇异变形杆菌(PM).将分离菌人工感染小鼠(0.20 mL/只,含菌量为108 cfu/mL),检测PM对小鼠的致病性.结果显示其中72株PM引起小鼠发病与死亡,为致病性PM,小鼠的死亡率在40%~100%.采用PCR方法及K-B药敏纸片法分别检测分离菌的毒力基因、相关耐药基因及耐药性,采用SPSS19 软件中的Fisher 确切概率法分析PM耐药表型与相关耐药基因之间的相关性.结果显示,毒力基因fliL、zapA、pmfA、atfA、rsbA、ureC、atfC在72株致病性PM中的检出率在63.4%~100%,其他毒力基因的检出率在2.7%~8.1%;72株致病性PM对阿莫西林、氨苄西林、安普霉素等12种药物耐药的菌株占51.4%以上,对其他药物耐药的菌株占6.9%~33.3%,均呈多重耐药性(MDR),且至少耐3类药物;72株致病性PM的β-内酰胺类耐药基因blaOXA、blaCTX-M、blaTEM,磺胺类耐药基因Sul1、Sul2、Sul3,氨基糖苷类耐药基因adA、aac(6')-Ib,四环素类耐药基因TetA、TetM的检出率在43.2%~98.6%,其他耐药基因检出率在4.2%~33.3%,其耐药表型与耐药基因型之间基本呈正相关(除多粘菌素类和大环内酯类药物外).本研究为致奶\肉犊牛腹泻的奇异变形杆菌病的防控提供了参考.

    犊牛奇异变形杆菌致病性毒力基因耐药性耐药基因

    家兔奇异变形杆菌的分离鉴定及致病性分析

    王佳宁李双军张自强王帅帅...
    32-38页
    查看更多>>摘要:为探究河南省某规模化兔场暴发的以精神萎靡、腹泻为主要症状的疾病病原,本实验随机选取6只病死兔剖检并观察其各组织剖检病变后,通过四区划线法分离纯化并增菌培养后,分别于普通琼脂培养基、血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基培养,并对分离菌进行疑似病原菌的PCR鉴定、球虫检测、生化鉴定、16S rRNA基因的PCR扩增、测序和序列分析,构建分离菌16S rRNA基因的进化树,进一步确定病原菌.剖检观察可见病死兔肾脏呈土黄色、肝脏肿大有出血点、胸腺出血、脾脏萎缩呈深褐色、肺脏发白且有散在出血点等.疑似病原菌的鉴定结果显示,大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、魏氏梭菌、沙门氏菌、波氏杆菌及球虫均呈阴性,且通过细菌的分离培养、16S rRNA基因的PCR扩增、测序并构建系统进化树,进一步确定引起该兔场发病的病原菌为奇异变形杆菌,并将其命名为HN001株.通过PCR检测该菌携带的毒力基因,并采集病死兔肝、肾、肠等病变组织制作病理切片,观察其病理变化.将HN001株以1011 cfu/mL感染家兔,一周后剖杀,观察各组兔的剖检病变,并再次从兔的内脏分离并鉴定病原菌.毒力基因的PCR检测结果显示,HN001菌株中鞭毛基因FliL和菌毛结构亚单位基因MrpA均为阳性,溶血素基因HpmA、金属蛋白酶结构亚单位基因ZapA和"雾蔓"菌毛迁移能力的调控基因RsbA均为阴性.组织病理学结果显示,病死兔肾、肝、胸腺、脾、肺脏和空肠组织均损伤严重,主要表现为炎性细胞浸润、散在分布部分红细胞等病理变化.家兔致病性试验结果显示,该病原菌感染兔后出现与自然感染兔类似的症状和脏器的剖检症状,但病变程度与自然感染兔相比较轻.且从病兔体内再次分离到与感染菌相同的菌株,表明奇异变形杆菌为该兔场暴发疾病的病原菌.本研究为兔奇异变形杆菌病的防控提供参考依据.

    奇异变形杆菌消化道疾病组织病理学毒力基因

    嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控宿主细胞剪接体转录机制的初步分析

    李芮芮史梦华张妍何洪琴...
    39-48页
    查看更多>>摘要:为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体LipofectamineTM 3000将其转染HEK293T细胞,继续培养至24 h、48 h时经western blot鉴定,结果显示,在48 ku(全长蛋白)和35 ku(成熟蛋白)出现特异性条带,表明Ats-1蛋白在细胞内可正确表达;且相较于24 h,48 h Ats-1蛋白在细胞内的表达量显著增加(P<0.05).将重组质粒pcDNA3.1-Ats-1和空质粒pcDNA3.1分别转染HEK293T细胞,48 h后收获细胞并裂解取裂解液,利用同量异位标签定量蛋白质组学方法(iTRAQ)筛选Ats-1表达后宿主细胞内差异显著表达的蛋白,并采用基因本体论(GO)分析差异显著表达蛋白的功能,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析差异显著表达蛋白参与的信号通路.从剪接体通路选取34个差异表达蛋白通过qRT-PCR验证.iTRAQ 结果显示,与空质粒转染细胞组相比,重组质粒pcDNA3.1-Ats-1转染细胞组共鉴定到852个差异显著表达的蛋白,其中表达显著上调蛋白406个,表达显著下调蛋白446个.GO功能分析结果显示,差异显著表达蛋白主要定位在膜、胞内膜结合细胞器、膜组分,参与大分子生物合成过程,有核酸和RNA结合活性.KEGG信号通路分析结果显示,差异显著表达蛋白显著富集于剪接体、N-糖基化、蛋白输出和RNA运输等信号通路.qRT-PCR结果显示,剪接体通路富集的差异显著表达蛋白仅O43143蛋白的mRNA转录水平上调,其他33个蛋白(A0A024R1K8、Q13435、Q13573等)mRNA的转录水平均显著下调,与iTRAQ的分析结果一致.综上所述,本研究首次证实Ats-1蛋白表达后可能参与宿主细胞中剪接体、N-糖基化和蛋白输出信号通路的调控,抑制宿主细胞中剪接体调控通路中部分蛋白的转录,从而可能抑制剪接体调控,该结果为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1在宿主细胞中的调控机制提供了新的方向和思路.

    Ats-1蛋白iTRAQ差异表达蛋白剪接体

    猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

    吕紫欣张鑫杰薛少华陈瑶...
    49-54页
    查看更多>>摘要:猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV.目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针.经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green I qPCR检测方法的符合率进行检测与对比.结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强.该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×102拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高.该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好.利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green I qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检测方法的阳性率分别为24.67%(37/150)和6.67%(10/150),二者的总符合率为80.67%(121/150).表明本研究建立的qPCR方法可以用于临床样品的检测.本研究建立的qPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性稳定性好,为PPV7的流行病学调查及检测提供了新的技术支撑.

    猪细小病毒7型TaqMan探针荧光定量PCR

    猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

    裴艳艳张梦琳许浒相丽润...
    55-60,69页
    查看更多>>摘要:猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起.为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒pET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性.SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,rLI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的rLI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法.各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的rLI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪IgG-HRP最佳稀释度为1∶10 000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min.利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51 200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性.结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好.利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况.结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI 在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在.本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI 血清流行病学调查提供技术支持.

    胞内劳森氏菌间接ELISA抗体检测LI0841重组蛋白

    猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

    曾苗苗刘大凯张记宇张燎原...
    61-69页
    查看更多>>摘要:为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬.构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集.进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答.为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID50)测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化.结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID50均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID50则均显著升高(P<0.05).针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 siRNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化.结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05).本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础.

    猪急性腹泻综合征冠状病毒自噬病毒复制LC3-Ⅱ

    表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

    李岩岩张帅赵云环任晓祥...
    70-77页
    查看更多>>摘要:为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap169~180-E2829~837)经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量.SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异.细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01).体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性.综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础.

    猪圆环病毒2型病毒样颗粒猪瘟病毒E2蛋白Cap蛋白