查看更多>>摘要:目的 探讨体内从头合成四氢生物蝶呤(BH4)过程中的限速酶三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1),关键磷酸化位点突变体(GCH1-S81A)对食管癌放射敏感性的影响及机制.方法 构建不同磷酸化水平的GCH1稳定过表达食管鳞癌(KYSE-150)细胞系,按照GCH1磷酸化水平及照射剂量,将实验分为空白对照组、空载病毒组、空载+照射组、野生GCH1组、GCH1磷酸化组、GCH1去磷酸化组、GCH1去磷酸化+照射组、回补验证组、回补验证+照射组.通过Western blot验证感染效率,CCK-8法检测各组肿瘤细胞存活率,克隆形成实验检测肿瘤细胞放射敏感性变化,流式细胞术检测各组肿瘤细胞凋亡率、活性氧(ROS)及脂质过氧化物含量变化,Western blot检测铁死亡相关蛋白表达变化.结果 GCH1去磷酸化组感染48 h后细胞内GCH1-S81磷酸化蛋白表达水平明显降低(t=9.35、16.57,P<0.05).与空载+照射组相比,GCH1去磷酸化+照射组细胞在10 Gy X射线照射24 h后存活率明显降低(t=26.97,P<0.05).在10 Gy X射线照射8 h后KYSE-150细胞中ROS含量,以及照射48 h后细胞凋亡率和脂质过氧化物水平,均上升明显(t=17.89~131.10,P<0.05),且在加入GCH1-S81A突变体后进一步加剧(t=157.06~97.81,P<0.05),这一现象能被补充野生型 GCH1 后抑制(t=66.38~23.08,P<0.05).与空载+照射组相比,去磷酸化+照射组在各个X射线剂量(2、4、6和8 Gy)照射下克隆形成能力均有所降低(t=7.31~8.16,P<0.05).GCH1-S81A突变能够降低铁死亡相关蛋白GPX4的表达(t=4.55,P<0.05),且在10 Gy的X射线照射后表达量进一步降低(t=12.98,P<0.05).结论 GCH1突变为GCH1-S81A去磷酸化后,可抑制食管癌细胞KYSE-150的生长并提高其放射敏感性,GCH1-S81A突变体有望为提高食管癌放疗疗效提供新的方式.