查看更多>>摘要:目的 探讨人脂肪间充质干细胞(ADSC)外泌体对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响及其机制.方法 该研究为实验研究.选取第4~5代人ADSC,采用差速超高速离心法分离并提取其上清液中的外泌体,对外泌体进行鉴定后使用.取24只成年雄性BALB/c小鼠,按照随机数字表法(分组方法下同)分成正常对照组、单纯盲肠结扎穿孔(CLP)组和CLP+ADSC外泌体组,对单纯CLP组小鼠行CLP(构建脓毒症小鼠急性肺损伤动物模型)后注射磷酸盐缓冲液,对CLP+ADSC外泌体组小鼠进行组名相应的处理,对正常对照组小鼠仅注射磷酸盐缓冲液,每组8只.术后24 h,采用苏木精-伊红染色观测小鼠肺组织形态,采用原位末端标记法检测肺组织细胞凋亡情况,采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)含量,使用酶标仪检测肺组织中丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)的含量,采用免疫荧光法检测小鼠肺组织细胞中CD86、CD206的表达.取小鼠巨噬细胞RAW264.7,分为空白对照组、单纯内毒素/脂多糖(LPS)组和LPS+ADSC外泌体组,在LPS+ADSC外泌体组和单纯LPS组细胞中分别加入LPS+ADSC外泌体、LPS进行培养,对空白对照组细胞进行常规培养.培养12 h后,采用相关试剂盒检测细胞中ATP含量、线粒体活性氧的阳性细胞百分比、线粒体膜电位情况,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中M1型极化标志因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、M2型极化标志因子精氨酸酶-1(Arg1)以及炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达量.以上实验除mRNA表达量的检测样本数为3以外,其余各指标的检测样本数均为4.结果 术后24 h,正常对照组小鼠肺组织结构清晰完整,无炎症细胞浸润;单纯CLP组较正常对照组小鼠的肺组织水肿明显,炎症细胞浸润现象明显,凋亡、坏死细胞明显增多;CLP+ADSC外泌体组较单纯CLP组小鼠肺组织水肿症状明显减轻,炎症细胞浸润明显减少,细胞凋亡、坏死情况明显改善.术后24 h,与正常对照组比较,单纯CLP组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量均明显增加(t值分别为50.82、30.81,P<0.05);与单纯CLP组比较,CLP+ADSC外泌体组小鼠血清中的TNF-α和IL-1 β含量均明显降低(t值分别为16.36、19.25,P<0.05).术后24h,与正常对照组比较,单纯CLP组小鼠肺组织中丙二醛含量明显升高(t=9.89,P<0.05),SOD含量明显降低(t=5.01,P<0.05);与单纯CLP组比较,CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织中丙二醛含量明显降低(t=4.38,P<0.05),SOD含量明显升高(t=2.97,P<0.05).术后24h,与正常对照组相比,单纯CLP组小鼠的肺组织中CD86阳性细胞占比明显升高,CD206阳性细胞占比明显减少;与单纯CLP组相比,CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织中CD86阳性细胞占比明显减少,CD206阳性细胞占比明显升高.培养12 h后,与空白对照组比较,单纯LPS组RAW264.7细胞中ATP含量明显降低(t=6.28,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组RAW264.7细胞中ATP含量明显升高(t=4.01,P<0.05).培养12h后,与空白对照组的(22±4)%比较,单纯LPS组RAW264.7细胞中线粒体活性氧的阳性细胞百分比(40±6)%明显增加(t=5.04,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组RAW264.7细胞中线粒体活性氧的阳性细胞百分比(30±5)%明显降低(t=2.65,P<0.05).培养12h后,与空白对照组相比,单纯LPS组RAW264.7细胞的线粒体膜电位明显降低;LPS+ADSC外泌体组RAW264.7细胞的线粒体膜电位介于空白对照组和单纯LPS组之间.培养12h后,与空白对照组相比,单纯LPS组RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达量均明显增加(t值分别为16.51、31.04、7.70,P<0.05),Arg1的mRNA表达量降低但差异无统计学意义(P>0.05);与单纯LPS组比较,LPS+ADSC外泌体组RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达量均明显降低(t值分别为11.38、22.58、5.28,P<0.05),Arg1的mRNA表达量明显升高(t=7.66,P<0.05).结论 人ADSC外泌体可能通过改善LPS诱导的小鼠巨噬细胞线粒体功能障碍,抑制巨噬细胞向M1型极化,减轻炎症反应,从而发挥改善脓毒症小鼠肺损伤的作用.