本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用。本发明的pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ?ID?NO:?1所示的序列。该pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。本发明的技术原理在于:NHEJ与CRISPR-Cas9联合应用,以实现在CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA造成DNA断裂后,NHEJ系统即可自动连接DNA断端,使细菌存活,而无需人工引入与靶序列具有同源性的双链DAN修复DNA断端,从而简化CRISPR-Cas9技术的操作步骤。