本发明属于基因工程技术领域,特别涉及尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记,其中Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示,X染色体特异分子标记NtX1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示;本发明还利用上述性染色体特异分子标记建立了尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定方法,通过PCR扩增上述性染色体特异分子标记中的任一个或多个,能够经济、快捷、准确地区分YY超雄鱼、XY雄鱼以及XX雌鱼,有助于通过YY超雄鱼培育路线实现全雄罗非鱼鱼苗的规模化生产,显著提高罗非鱼的养殖产量,降低养殖成本,提高经济效益。