本发明涉及一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法,属于生物技术领域。本发明的制备方法采用新生仔猪的小肠段作为材料,提供了一种快速、便捷、高效率的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法,制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20?30代次以上。本发明制备方法可在短时间内制备出大量健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞,供细胞生物学、预防兽医学、病毒学、免疫学、动物营养学等实验研究或猪腹泻病毒类疫苗生产及抗原制备。同时,本发明首次制备出健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株,填补了生命学科研究领域缺乏单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株的空白,具有积极的效果。