本发明公开了一种肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用,利用提取EV?D68病毒基因组RNA,通过反转录和PCR扩增得到VP1基因的cDNA,将其克隆到克隆载体,再转入表达载体得到重组表达质粒,转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达,表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化得到可以作为鉴别诊断抗原的VP1融合蛋白。利用重组VP1蛋白作为免疫原,免疫BALb/c小鼠取免疫小鼠脾脏并将其与骨髓瘤细胞SP2/0融合,获得了可表达VP1抗体的杂交瘤细胞株,此细胞能够稳定分泌单克隆抗体,通过流式细胞术来检测抗体的免疫原性。本发明同时获得了VP1单克隆抗体的H链、L链可变区核苷酸及氨基酸序列。