本发明提供一种柑橘氧甲基转移酶CitOMT2的体外酶活应用。通过原核表达得到的CitOMT2重组蛋白可以在体外高效催化多种黄酮类化合物在特定位点发生甲基化,即催化木犀草素、槲皮素、3?甲基槲皮素、圣草酚、五羟黄酮、杨梅素在B环间位的羟基处发生甲基化,生成相应的3'或3'/5'甲基化衍生物;催化黄芩素在7位羟基处发生甲基化生成7?甲基黄芩素。本发明首次鉴定得到一个能够催化类黄酮3'/5'/7位点的氧甲基转移酶CitOMT2。CitOMT2的这种多位点催化特性有助于快速而准确地扩大O?甲基化类黄酮的多样性,具有广阔的前景和应用价值。