本发明属于生物技术领域,具体涉及小鼠转录因子敲除筛选文库及其构建方法。所述小鼠转录因子敲除筛选文库,包括靶向鼠源转录调控相关转录因子基因的sgRNA+Cas9表达质粒,靶向鼠源转录调控相关转录因子基因包括Basic?Domian?group转录因子基因、Beta?Scaffold?Factors转录因子基因、Helix?turn?helix转录因子基因、Other?Alpha?Helix?Group转录因子基因、Unclassified?Structure转录因子基因和Zinc?Coordinating转录因子基因。