本发明公开了与玉米南方锈病基因紧密连锁的分子标记组合，包括分子标记P2.913，扩增该分子标记P2.913的一对引物序列如SEQ?ID?NO:1和2所示。还包括分子标记P2.649，扩增该分子标记P2.649的一对引物序列如SEQ?ID?NO:3和4所示。还包括分子标记P3.187，扩增该分子标记P3.187的一对引物序列如SEQ?ID?NO:5和6所示。本发明还公开了该分子标记组合在玉米南方锈病基因定位和玉米遗传育种中的应用。本发明用于培育玉米南方锈病抗性株系，拓宽了玉米抗病资源种质研究的方法，明确了玉米抗南方锈病性状的遗传规律，对于玉米抗病机制的理论研究具有极大地指导意义。
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