摘要
[目的]克隆犬转录因子ELF4基因(cELF4),体外表达重组cELF4蛋白(rcELF4)并制备抗该蛋白的卵黄抗体(IgY),为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料.[方法]采用RT-PCR扩增cELF4基因,将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征.将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET28a-cELF4,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定.将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂(ISA 15AVG、ISA 71VG、ISA 201VG)乳化制备免疫原,通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量.构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4,转染细胞后,利用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)分析cELF4特异性IgY的免疫活性.[结果]cELF4基因(GenBank登录号MZ198105)的开放阅读框(ORF)为1992 bp,编码663个氨基酸残基.cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高(99.3％),而与小鼠的相似性最低(81.5％).结合系统进化结果发现,cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近,而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远.rcELF4蛋白分子量大小约100 kD,可刺激鸡产生相应抗体,ISA 15AVG、ISA 71VG和ISA 201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值,其中ISA 201VG组效价最高(>128000倍),且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳,首免后35 d达峰值,其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高,为256000倍.3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液,与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应.rcELF4蛋白定位在细胞核.[结论]rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达,且存在翻译后修饰现象,不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响,所制备rcELF4抗体免疫活性良好,且与人ELF4蛋白存在交叉反应.
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