摘要
[目的]克隆花䱻抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考.[方法]基于花䱻转录组文库测序结果,克隆Amh基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析.构建重组表达质粒pET32a-Amh,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况.同时,利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况.[结果]克隆的花䱻Amh基因cDNA序列全长为1849 bp,开放阅读框(ORF)为1671 bp,编码556个氨基酸残基.系统进化分析结果显示,花䱻Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支,表明其亲缘关系较近.将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体,通过酶联免疫方法(ELISA)检测其抗体效价为2.4×106以上,Western blotting检测显示抗体具有特异性.AMH蛋白在花䱻卵巢颗粒细胞表达.利用不同浓度的雌二醇处理花䱻60 d后发现,低浓度雌二醇(100μg/g)促进花䱻卵母细胞生长,卵巢内皮质液泡数量增多.经雌二醇处理后,卵巢中Amh基因的表达量降低,说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用.[结论]Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域,在卵巢颗粒细胞表达,且响应雌激素的调控,可能在花䱻卵巢发育中发挥调控作用.
基金项目
国家自然科学基金(31872199)
国家自然科学基金(U2004146)
河南省科技攻关计划重点项目(2121102110386)
河南省高等学校重点科研项目(21A240003)
万方数据