摘要
[目的]构建I型胶原蛋白α1链基因(COL1A1)过表达载体,并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响,为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础.[方法]通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段,然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1(+)线性化载体上,再通过酶切连接获得COL1A1基因全长,构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体;转染山羊卵巢颗粒细胞后,通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率,采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况,并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基(FSHB)]表达的影响.[结果]COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp,连接至pcDNA3.1(+)线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体.Western blotting检测结果表明,pcDNA3.1(+)-COL1A1转染颗粒细胞48 h后,COL1A1蛋白表达量极显著高于pcDNA3.1(+)空载体转染组(P<0.01,下同);免疫荧光检测结果表明,COL1A1蛋白在颗粒细胞细胞核及细胞质中均有表达,但在细胞核中的表达水平更高;实时荧光定量PCR检测结果表明,pcDNA3.1(+)-COL1A1转染组颗粒细胞中COL1A1、COL2A1和COL3A1胶原蛋白家族基因及GDF9、FSHB和BMP15产羔相关基因的相对表达量极显著高于pcDNA3.1(+)空载体转染组,但对BMPR1B基因的表达无显著影响(P>0.05).[结论]COL1A1基因在卵巢颗粒细胞中广泛表达,其过表达能极显著促进胶原蛋白家族基因COL2A1和COL3A1及产羔相关基因GDF9、FSHB和BMPR1B在颗粒细胞中的表达,即COL1A1基因可协同胶原蛋白家族基因的表达促进ECM合成来影响卵巢组织结构、胚胎发育及促进性腺激素表达,进而影响山羊产羔性状,可作为影响贵州黑山羊多羔候选基因进行深入研究.
基金项目
贵州省科技支撑计划(黔科合支撑2022一般089)
贵州省教育厅教育部重点实验室联合开放项目(黔教合KY字2020244)
贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字2020074号)
黔南州农业攻关项目(黔南科合202127号)
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