摘要
[目的]构建鼠源Ⅲ型中间丝蛋白Desmin真核/原核表达载体,明确鼠源Desmin蛋白生物学功能,为在体外及细胞内表达系统中鉴定Desmin互作蛋白及探索其作用网络提供理论依据.[方法]通过RT-PCR克隆Desmin基因,分别构建原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin.F1ag和真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag,以IPTG对原核表达载体进行诱导表达,并通过ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA 和 SWISS-MODEL等在线 软件对Desmin蛋白进行生物信息学分析.[结果]鼠源Desmin基因长1410 bp,选用pGEX-4T-1载体和pcDNA3.0载体分别成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Desinimin-Flagn.原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag转化大肠杆菌后经IPTG诱导,成功表达出70 kD的融合蛋白DesminiFlag;真核表达载体pcDNA3.0-DesminF1ag转染BHK-21细胞,通过Western blotting在56 kD处检测到Flag标签,即Desmin蛋白能在真核细胞成功表达,且主要定位在细胞质.Desmin蛋白由470个氨基酸残基组成,分子量为54 kD,分子式为C2299H3722N688O755S13,理论等电点(pI)为5.21,属于不稳定蛋白;蛋白脂溶系数为79.94,平均亲水系数(GRAVY)为-0.721,推测为亲水性蛋白;无跨膜结构域和信号肽;其二级结构由α-螺旋(占67.59％)、无规则卷曲(占22.39％)、β-转角(占1.92％)和延伸链(占8.10％)构成.[结论]鼠源Desmin蛋白在原核表达体系中主要以包涵体形式进行表达,在真核细胞中表达主要定位于细胞质,呈骨架结构分布,其理化性质不稳定,属亲水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽.Desmin作为一种重要的Ⅲ型中间丝蛋白,在神经肌肉组织信号转导及与相关蛋白发生相互作用方面发挥重要作用.
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