摘要
细胞色素P450酶(简称P450酶)是天然产物合成过程中的关键修饰酶,其催化的杂泛性使得一种生物合成途径中的一个P450酶可以氧化多个中间体导致多种结构类似物的产生.P450酶催化选择性的传统调控策略主要为催化结构域的改造以及氧化还原伴侣工程,然而在由P450酶、细胞色素P450还原酶(CPR)、生物膜构成的Ⅱ型P450酶催化系统中,蛋白跨膜域、膜组分的代谢等因素对其选择性的影响尚不清晰.为探索Ⅱ型P450酶催化选择性调控的新策略,解决甘草次酸合成过程中关键Ⅱ型P450酶CYP72A63(T338S)的底物选择性差而产生副产物11-脱氧甘草次酸的问题,本文通过在CYP72A63(T338S)的N端融合酵母内源P450酶以及其他内质网定位蛋白的跨膜域方式重塑CYP72A63(T338S)的跨膜结构,改造重要膜组分鞘脂的代谢途径,调节生物合成途径中具有底物竞争关系的P450酶表达比例的三种策略,以酿酒酵母为底盘菌株,通过体内验证的方式,探究了跨膜域、鞘脂代谢以及具有底物竞争关系的P450酶表达比例的变化对CYP72A63(T338S)催化特性的影响.结果表明,跨膜域的重塑以及鞘脂代谢的调节显著改变了CYP72A63(T338S)催化的底物选择性,N端跨膜域融合NTE1N以及敲除二氢鞘氨醇4-羟化酶的编码基因SUR2显著抑制了其对β-香树脂醇的氧化选择性;过表达来自毕赤酵母的葡萄糖神经酰胺合酶则会显著促进其对β-香树脂醇的氧化选择性;通过提高Uni25647(来源于乌拉尔甘草的11-氧-β-香树脂醇合成酶)的表达比例,促进了其与CYP72A63(T338S)竞争β-香树脂醇的能力,完全抑制了副产物11-脱氧甘草次酸的合成.本文为P450酶,尤其是膜定位的Ⅱ型P450酶催化特性调控的研究提供了新的思路和方法.
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