为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化.以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法.结果 表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21 (DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的 蛋白.重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期.确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min.用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验变异系数分别为0.70％～4.70％和0.50％～5.60％,均小于6.00％,该方法重复性较好.说明本试验建立的检测PlpE抗体的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床牛血清抗体的检测.
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