牛源乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌三重实时荧光定量PCR法的建立及初步应用

Establishment and preliminary application of a triple real-time fluorescent quantitative PCR method for bovine-derived Streptococcus uberis,Streptococcus agalactiae,and Streptococcus dysgalactiae

郑添予 ¹于龙政 ²徐晓琪 ³李长春 ³孙兴忠 ⁴金春梅 ²王楠⁴

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作者信息

1. 延边大学农学院,吉林延吉133400;吉林省畜牧兽医科学研究院,长春130062
2. 延边大学农学院,吉林延吉133400;延边大学东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心,吉林延吉133002
3. 延边大学农学院,吉林延吉133400
4. 吉林省畜牧兽医科学研究院,长春130062
折叠

摘要

为了建立快速检测牛乳腺炎主要病原菌乳房链球菌、无乳链球菌及停乳链球菌的方法,试验根据GenBank中3种细菌的非翻译区基因设计了 1对特异性引物和3个探针,建立了针对乳腺炎链球菌属3种细菌的三重实时荧光定量PCR法;对温度梯度、探针引物配比浓度进行优化,并对该方法的灵敏性和特异性进行评价;应用建立的方法对吉林省9个地区18个养殖场720份奶牛奶样进行检测.结果表明:该方法最佳反应温度为60.2℃;引物和探针浓度最佳配比扩增体系为PCR Mix 10 μL,上下游引物各 1 μL,Uberi-P 0.8 μL,Dysg-P 0.7 μL,Agala-P 0.8 μL,DNA 模板 2 μL,无核酸水3.7 μL.该方法对无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌核酸浓度最低检出限分别为1.2×10-5 ng/μL、1.4×10-5 ng/μL和1.0×10-5 ng/μL,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、粪肠球菌、克雷伯菌、沙门氏菌、产气荚膜杆菌等多种病原均无交叉反应.应用该方法对720份奶样进行检测,其中无乳链球菌检出率为3.5％(25/720),乳房链球菌检出率为1.0％(7/720),停乳链球菌检出率为2.4％(17/720).说明建立的三重实时荧光定量PCR法具有灵敏性高、特异性强等优点,可用于奶牛乳腺炎链球菌属细菌的病原学检测.

关键词

奶牛/乳腺炎/链球菌/实时荧光定量PCR/流行病学调查

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基金项目

吉林省科技发展计划(20180623033TC)

高等学校学科创新引智计划(111计划)(D20034)

出版年

2022

黑龙江畜牧兽医(下半月)

ISSN：

参考文献量7

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