目的 构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因(rCGRP)的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/rCGRP.方法 应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA,RT-PCR扩增rCGRPcDNA(PCR引物上加上双酶切位点),产物通过Hind Ⅲ和BamH I酶切、纯化、连接,将目的 基因插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),再将重组质粒转化感受态细菌,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆.结果 (1)RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;(2)重组克隆鉴定①PCR鉴定.PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;②酶切鉴定,抽提质粒经双酶切.酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带,分别和pcDNA3.1(+)和rCGRPcD-NA大小相吻合;③DNA测序,测序结果经BLAST分析,与rCGRP基因编码区全长序列完全一致.结论 (1)大鼠脑组织中有rCGRP的表达;(2)通过RT-PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/rCGRP.
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