摘要
随着转基因产品在农产品国际贸易中的比重不断增加,因混杂少量目的国未批准品系而引发的低水平混杂事件日益凸显.为了应对低含量转基因成分的精准定量检测需求,针对我国未批准、国际上已经商业化种植的转基因油菜MS11品系,建立了双重数字PCR定量检测方法.对5套不同油菜内源基因与MS11品系检测引物探针组合进行筛选,选出相互抑制效应低、反应效率高、内源基因单拷贝、数字PCR阳性微滴单元与阴性微滴单元区分明显的引物探针组合.后对PCR反应退火温度、引物探针浓度等进行优化.在筛选出适宜的引物探针组合,以及优化后的反应条件基础上,对反应体系的特异性、可重复性和定量精密度、灵敏度、定量准确性等进行测试.筛选和优化结果表明,油菜内源基因PEP与MS11品系引物探针组合在退火温度为58℃,引物探针比为1.5:1.0时,反应效率最高.方法特异于转基因油菜MS11品系检测,在其他转基因作物品系和非转基因作物中无显著扩增.从10拷贝/μL到8 000拷贝/μL 3个数量级的DNA模板各重复间测定绝对拷贝数和百分比含量的相对标准偏差均在可接受范围内,可重复性和定量精确度高.方法的检测下限低至2拷贝/μL,定量下限为10拷贝/μL基因组DNA.对10％、2.0％、0.5％和0.1％4个MS11品系成分含量样品定量结果表明,测定值与设定值间的偏差(bias)均在±25％之间,定量准确性高.结论表明,建立的转基因油菜MS11品系双重数字PCR精准定量方法适用于对低含量MS11品系成分的精、准定量,可以满足口岸对低水平混杂问题的应对需求.
基金项目
上海市"科技创新行动计划"技术标准项目(21DZ2203000)
海关总署科研项目(2021HK155)
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