本研究旨在克隆奶牛(Bos taurus)维甲酸相关孤儿受体α(retinoic acid-related orphan receptor alpha,RORα)的蛋白编码序列(coding sequence,CDS),预测分析其结构与功能特征并验证其真核表达载体在HEK293T细胞中的过表达效果,进一步检测RORα基因在奶牛不同组织的表达谱.本研究提取了奶牛肝脏组织的总RNA,反转录得到cDNA,经过PCR扩增后获得奶牛RORα基因的CDS区片段,随后将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA线性化载体进行同源重组连接.转化感受态细胞DH5α后,对初步鉴定为阳性克隆的重组质粒进行测序.结合测序结果,利用ExPASy、Protscale和DNAstar等生物信息学软件,对奶牛RORα蛋白的理化性质和功能特性进行预测分析.将对照组空质粒pcDNA3.1-Puro-N-3HA和试验组重组质粒pcDNA-3.1-3HA-RORα分别转染至HEK293T细胞,借助实时定量PCR和蛋白质印迹法检测奶牛RORα基因的过表达效果.借助半定量RT-PCR技术检测奶牛RORα基因在肝脏、脾脏和肌肉等7个组织的相对表达量.PCR结果显示,成功克隆了奶牛RORα基因的CDS区片段;酶切及测序结果表明重组质粒pcDNA3.1-3HA-RORα构建成功;生物信息学软件预测分析结果表明,奶牛RORα蛋白三级结构与山羊(Capra hircus)、小鼠(Mus musculus)的高度相似;不同物种间同源性比对显示,奶牛RORα基因与山羊的相似性最高;实时定量PCR和蛋白印迹法结果表明,与对照组相比,试验组HEK293T细胞中奶牛RORα基因的mRNA和蛋白表达水平均显著升高;半定量RT-PCR结果表明,在所检测的7个组织中,奶牛RORα基因在肝脏表达量最高,在脾脏表达量最低.本研究成功克隆了奶牛RORα基因的CDS区片段,在HEK293T细胞中验证了其真核表达载体在mRNA和蛋白水平的表达效果,并分析了其结构与功能特征,检测了其在不同组织的表达谱,为深入探究其在奶牛生殖与代谢调控中的作用机制提供了前期基础.
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