摘要
[目的]本研究旨在通过克隆茶尺蠖Ectropis obliqua解毒相关无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)基因EoPPase672,并对其进行原核表达和功能验证,为更好地了解EoPPase672在茶尺蠖解毒过程中的作用及相关功能的应用提供理论依据.[方法]从茶尺蠖转录组数据库中筛选到EoPPase672 cDNA,构建原核表达载体pET-32a-EoPPase672,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),SDS-PAGE 及 Western blot 鉴定重组表达蛋白;测定 EoPPase672 的浓度以及酶促反应最适温度、最适pH和最适金属离子.利用qRT-PCR检测亚致死浓度(LC10=2.08 mg/L)溴氰菊酯刺激后不同时间不同龄期茶尺蠖幼虫中EoPPase672的表达水平.基于PPase的特性,分析重组蛋白EoPPase672在PCR反应中对焦磷酸盐(PPi)的去除效果和对PCR扩增效率的影响.[结果]通过原核表达和纯化获得重组蛋白EoPPase672.通过无机磷酸盐(Pi)含量标准曲线测得该酶的比活力为1 279.6 U/mg,酶促反应的最适温度为65℃、最适pH为7.5、最适金属离子为Mg2+.茶尺蠖幼虫被溴氰菊酯(2.08 mg/L)刺激12 h后,2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比显著上调,4龄幼虫EoPPase672的表达量小幅上调;被溴氰菊酯刺激24 h后,2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比仍然显著上调,但与刺激12 h的2和3龄幼虫中的相比下调.在PCR反应中添加重组蛋白EoPPase672后,部分PPi被水解,解除了 PPi对PCR扩增的抑制作用,对PCR扩增效率起到了增强效果.[结论]这些结果表明,重组蛋白EoPPase672可提高PCR扩增效率,EoPPase672基因可能参与了茶尺蠖的解毒过程.研究结果为进一步研究茶尺蠖EoPPase672的功能提供了依据.
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