摘要
[目的]细胞凋亡是真核生物中保守的细胞程序化死亡,由蛋白酶caspase介导.Strica是果蝇Drosophila中一个特殊的caspase,至今未有其商品化抗体且生化功能未知.本研究旨在通过克隆、原核表达纯化果蝇Strica蛋白并制备其多克隆抗体来初步研究其功能.[方法]根据果蝇Strica的基因序列构建原核表达载体并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,表达Strica蛋白;将表达纯化后的Strica蛋白免疫家兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot分别测定抗体效价和灵敏度;利用前期构建的过表达载体pAc5-V5-Strica进行转染果蝇S2细胞,设计合成siRNA进行RNAi验证该抗体的特异性;利用该抗体通过免疫荧光实验检测Strica在果蝇S2细胞中的亚细胞定位;利用该抗体通过Western blot实验探究放线菌酮(10 μg/mL)处理后果蝇S2细胞中Strica蛋白的激活状态.[结果]获得了果蝇Strica重组蛋白;ELISA检测Strica抗体的效价大于1:25 600;Western blot鉴定该抗体在1:10 000的稀释度下能与重组蛋白反应;该抗体可以检测到S2细胞中过表达以及内源性Strica蛋白;Strica蛋白在S2细胞质中呈现散点分布;放线菌酮介导Strica蛋白的切割激活.[结论]成功制备了兔抗果蝇Strica多克隆抗体.Strica响应凋亡刺激物放线菌酮激活,推测Strica参与果蝇的细胞凋亡过程.本研究为进一步深入研究Strica的功能奠定了实验基础.
基金项目
湖北省科技厅自然科学研究项目(2021CFB472)
湖北医药学院人才启动金项目(自然科学类)(2019QDJZR09)
湖北省教育厅项目(Q20212106)
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