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西方蜜蜂m6 A甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式

Gene cloning,polyclonal antibody preparation,and expression pattern of m6A methyltransferase in Apis mellifera(Hymenoptera:Apidae)

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  • 万方数据
[目的]本研究旨在克隆西方蜜蜂Apismellifera RNA m6A甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础.[方法]通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证.使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树.通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性.采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量.[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C1957H3113N567O589S15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerania、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲 熊蜂 Bombus terrestris、金环胡蜂 Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂 B.impatiens 和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60％)且亲缘关系最近.制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512K)且特异性较强.AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量.[结论]研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础.

Apis melliferaN6-methyladenosinemethyltransferase 14spatiotemporal expression patternMT-A70antibody

吴鹰、刘治滩、赵浩东、郭思佳、刘小玉、张艺琼、冯佩林、赵红霞、徐细建、陈大福、付中民、郭睿

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福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州350002

广东省科学院动物研究所,广州510260

江西省养蜂研究所,南昌330000

福建省蜂疗研究所,福州350002

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西方蜜蜂 N6-甲基腺苷 甲基化转移酶14 时空表达模式 MT-A70 抗体

国家自然科学基金国家自然科学基金国家现代农业产业技术体系专项资金项目福建省自然科学基金面上项目福建农林大学硕士生导师团队项目(郭睿)福建农林大学科技创新专项基金福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)科研扶持项目

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2023

10.16380/j.kcxb.2023.07.003

昆虫学报
中国科学院动物研究所,中国昆虫学会

昆虫学报

CSTPCDCSCD北大核心
影响因子：0.756
ISSN：0454-6296
年,卷(期)：2023.66(7)
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