基于蛋白质组学自下而上研究策略,采用纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用法(Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)筛选、鉴定大西洋鲑中生物标志性肽段和过敏原β-小清蛋白特异性肽段,并提出了UHPLC-MS/MS测定其含量的方法.称取5 g处理好的样品,加入10 m L正己烷除脂,离心,于沉淀中加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(提取剂),涡旋,于60℃水浴加热30 min,再用20 mL冷丙酮富集、纯化,得到的蛋白提取液经胰蛋白酶酶解后,采用Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS初步筛选大西洋鲑生物标志性肽段与过敏原β-小清蛋白特异性肽段,用UHPLC-MS/MS对初筛的肽段进行多反应监测(MRM)模式验证.在酶解后的溶液中加入内标,采用UHPLC-MS/MS测定,内标法定量.结果显示:筛选出3条可用于定量的大西洋鲑生物标志性肽段VAVNVEETK、VAPLSED-FK、LTEIQSLER和1条过敏原β-小清蛋白特异性肽段TFFHTIGFASK;VAVNVEETK、VAPLSEDFK、LTEIQSLER标准曲线的线性范围在5.00μmol•L-1以内,TFFHTIGFASK标准曲线的线性范围在10.00μmol•L-1以内,检出限(3S/N)为0.32～1.55μg•g-1;空白样品中4条肽段的加标回收率为90.2％～105％,测定值的相对标准偏差(n=6)为1.5％～4.6％;方法用于测定大西洋鲑贮存过程中VAVNVEETK、VAPLSEDFK、LTEIQSLER、TFFHTIGFASK的含量,LTEIQSLER和TFFHTIGFASK含量没有发生明显变化,而VAVNVEETK和VAPLSEDFK含量随着贮存天数的延长逐渐降低,其中VAPLSEDFK适用于大西洋鲑新鲜度评价.
万方数据
维普
