摘要
中国每年进口大量转基因大豆(Glycine max),其中主要为cp4 epsps转基因大豆,需建立一种针对cp4 epsps转基因大豆的高效的快速ELISA鉴定方法.本研究利用合成多肽法将CP4-EPSPS蛋白分段表达,初步定位了5株CP4-EPSPS单克隆抗体识别的抗原表位,采用方阵法对识别不同抗原表位的单抗进行配对,以P/N最大值确定工作抗体及其浓度,通过控制变量法,确定最佳检测条件,建立cp4 epsps转基因大豆快速双抗夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法.并通过特异性试验、重复性试验、阳性判定值试验,对建立的检测方法进行性能评估,利用建立的检测方法和商品化试剂盒同时对130份样品进行检测,比较其符合率.通过方阵法确定单抗2D3为捕获抗体,单抗1D10为检测抗体时检测信号最强,2D3工作浓度为20μg/mL,1D10工作浓度为10μg/mL.捕获抗体最佳包被条件为37℃封闭2 h,4℃过夜,样品与检测抗体先后加入酶标板37℃共同孵育10 min.该方法灵敏度为叶片或籽粒稀释160倍(g/mL),待检叶片最佳稀释范围是10～80(g/mL)、籽粒最佳稀释范围是10～40(g/mL).板内、板间变异系数小于25％,阳性判定值为1.41.对70份大豆叶片、40份大豆籽粒和20份豆浆进行检测,结果与CP4-EPSPS蛋白ELISA试剂盒检测结果比较,符合率为100％,且与其他蛋白不发生交叉反应.本研究建立的快速ELISA检测方法具有良好的准确性、重复性和特异性,该检测方法仅需30 min完成检测,适用于大豆植株、大豆籽粒及豆浆的快速鉴定.
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