摘要
植物内生细菌是重要的微生物新资源.常用细菌16S rDNA基因扩增用的引物与植物叶绿体、线粒体等细胞器DNA序列具有相似性,这给植物内生细菌的高通量测序研究带来了极大挑战.本文研究目的在于排除非目标DNA对种子内生细菌菌群高通量测序的干扰,筛选获得适合分析水稻种子内生细菌的优选引物对,分析水稻种子内生细菌菌群结构.以粳稻品种'日本晴'(Oryza sativa spp.japonica)的种子为材料,以7对常用的细菌16S rDNA基因高通量测序PCR引物为候选序列.利用NCBI数据库与已有植物基因组序列进行生物信息学比对分析,并进行高通量测序试验验证.结果如下:Blast比对分析发现引物对dP1、dP3和dP7与植物细胞器基因序列的同源性较低,预测扩增水稻细胞器及染色体基因组的可能性较小,确定为初筛引物.应用3对初筛引物对水稻种子内生细菌进行Illumina MiSeq高通量测序,经质量控制(quality control,QC)、去杂、去细胞器处理,引物对dP7获得的剩余优质reads序列数目分别是dP1和dP3的11.7倍和5.3倍,产生的内生细菌操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)最多,而且鉴定的菌属丰度和种类显著高于其他2对引物,被确定为优选引物对.基于dP7引物对的高通量测序结果显示,粳稻'日本晴'水稻种子内生细菌菌群丰富,共获得632个OTUs,隶属于5个门,8个纲,13个目,32个科,51个属.其中,优势菌属包括芽胞杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus),占比分别为64.46％、15.07％,常见菌属为泛菌属(Pantoea)和微小杆菌属(Exiguobacterium),占比分别为4.27％和3.61％.综上所述,PCR引物对植物内生细菌菌群高通量测序结果影响较大.dP7是水稻种子内生细菌16S rDNA基因高通量测序的优选引物,水稻种子内生细菌群落较为丰富.本研究结果为微生物资源开发和探索内生细菌与水稻宿主的相互作用机制提供了基础性资料.
基金项目
国家自然科学基金(31772100)
浙江省一流学科建设经费(食品科学与程)(1110JYN6517001G)
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