摘要
牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disearse complex,BRDC)是由多种细菌、病毒混合或继发感染和环境多因素作用下引起牛(Bos taurus)的一种危害严重的呼吸道疾病的总称,严重危害牛产业的健康发展.本研究基于牛传染性鼻气管炎病毒(Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)糖蛋白B(glycoprotein B,gB)基因(GenBank No.NC0847.1)、牛支原体(Mycoplasma bovis)脂蛋白48(1ipoprotein 48,P48)基因(GenBank No.DQ020482.1)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)溶血素(hemolysin,khe)基因(GenBankNo.KX842080.1)设计3对引物、扩增预期片段分别为727、421和192 bp的核酸片段,并对PCR扩增条件中的退火温度、引物浓度进行优化,在此基础上进行特异性试验和临床样品检测,初步建立检测3种病原的多重PCR、完成检测样品评估.研究结果表明,建立的多重PCR检测方法退火温度在48～54 ℃范围内,52.7 ℃时最佳;在引物浓度1～15 μmol/L优化区间内,IBRV、M.bovis和K.pneumoniae引物最佳浓度分别为:1、1和15 μmol/L;IBRV最低检出量为103TCID50,K.pneumoaiae的最低检出量为8.1×101 cfu,M.bovis最低检出量为6.5×10'cfu;与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmaonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteus mirabillis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙雷氏菌(Serratia marcescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus)无交叉反应;临床样品检测结果与病原分离鉴定一致.该多重PCR方法的建立为由这3种病原引起的牛呼吸道疾病综合征的诊断和防控提供了有力的技术支撑.
基金项目
甘肃农业大学学科建设专项基金(GSAU-XKJS-2018-075)
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