摘要
类ASH2蛋白(absent,small,or homeotic-like,ASH2L)是重要的组蛋白甲基化修饰酶,参与多种细胞发育过程.但其在雄性生殖细胞发生过程中的功能和分子机制尚不清晰.本研究旨在研究Ash2l在鸡(Gallus gallus)雄性生殖干细胞形成中的表达规律并构建Ash2l真核融合表达载体,利用NCBI保守结构域分析、UniPort、TMHMM Server v.2.0和SignalP在线网站分析ASH2L的保守结构域、亲疏水性、跨膜结构域和信号肽表达.收集18.5 d鸡(Gallus gallus)胚不同组织和不同阶段的鸡细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)、原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)、精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSC)和鸡成纤维细胞(chicken embryonic fibroblast,CEF),qRT-PCR检测Ash2l 的表达;双酶切和测序对重组载体pcDNA3.1-Ash2l-Flag进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot检测重组蛋白在PGC中的表达;通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证重组蛋白和互作蛋白的结合.结果显示,ASH2L蛋白含有2个保守结构域,SPRY(SPIa and ryanodine receptor,SPRY)-Ash2和 PHD(plant homeodomain)-ash2p-like 具有组蛋白甲基化酶特征结构域;其亲水性高、不含跨膜结构域且无信号肽表达.qRT-PCR检测结果发现,Ash2l在睾丸中表达最高,极显著高于其他组织(P＜0.01),在PGC中表达极显著高于其他细胞(P＜0.01).双酶切结果表明,Ash2l正确插入pcDNA3.1载体,未发生移码和突变.qRT-PCR结果表明,PGC中重组载体可过量表达Ash2l基因;Western blot结果显示,PGC中成功表达重组蛋白.Co-IP结果发现,重组蛋白可与互作蛋白Dpy30组蛋白甲基化酶复合体调节亚基(Dpy-30 histone methyltransferase complex regulatory subunit,DPY30)和 WD 重复域5(WD repeat containing protein 5,WDR5)结合,形成复合体.本研究结果为探明Ash2l在鸡雄性生殖细胞形成中的功能和机制研究提供参考依据和技术手段.
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