摘要
剑麻紫色卷叶病是近年来剑麻(Agave sisalana)上发生的一种毁灭性病害.本课题组前期研究表明,该病与植原体高度相关.建立一种高效的分子检测技术对于植原体的深入研究及病害监测与检测非常必要.本研究拟建立剑麻紫色卷叶病相关植原体的高效单管巢式PCR检测技术.首先对单管巢式PCR反应体系的内外引物退火温度进行单因素试验;确定退火温度后,利用正交设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓度、dNTPs浓度和Ex Taq酶用量等关键因素进行优化.结果显示,当外引物Sis-F1/R1退火温度为64℃、内引物Sis-F2/R2退火温度为54℃,通过正交设计试验最终筛选出的最佳反应体系(25 μL)为:10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 5μL,Ex Taq DNA Polymerase 1 μL,15 μmol/L 的内引物 Sis-F2/R2各 1 μL,0.02 μmol/L 的外引物 Sis-Fl/Rl 各 1 μL,模板 DNA1 μL,ddH2O 11.5μL.上述反应体系只对紫色卷叶病植株DNA模板扩增出条带,具有高度特异性;最低检测限为植原体质粒浓度≥1fg/μL.本研究所建立的剑麻紫色卷叶病相关植原体单管巢式PCR检测体系为后续病害监测、相关性调查、致病性以及功能验证等方面的研究提供技术支持.
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