摘要
MYB转录因子在植物生长发育和抵御胁迫中起着重要的作用.为开展烟草(Nicotiana tabacum)NtMYB4a的功能研究和新种质的创制,本研究以NtMYB4a为靶基因,根据其CDS序列在第1和第3外显子上选定两个靶标Y1和B1,分别合成Oligo二聚体后和CRISPR载体连接,转化大肠杆菌(Escherichia coil)感受态DH5α后提取质粒并测序,将测序正确的质粒Y1-1和B1-1经LguⅠ酶切后用T4连接酶进行重组连接,成功构建了CRISPR/Cas9编辑系统的双靶标敲除载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法来转化烟草,经PCR和测序鉴定获得29株阳性植株,阳性率为24.37％,其中15株在靶点和非靶点处发生了不同程度的突变,共有4种突变类型,突变率为51.72％.初步观察发现NtMYB4a编辑T0代植株出现不同程度的矮化和花色变异,甚至死亡.qRT-PCR分析发现T0代植株花、茎、叶中NtMYB4a表达量不同程度下调.本研究为后续开展NtMYB4a的功能和以NtMYB4a为节点的分子调控机制研究提供了基础资料.
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